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原文传递一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法

专利名称：	一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法
摘要：	本发明公开了一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法，该方法包括以下步骤：Step1、确定研究内容，研究内容包括：1)确定DOM对土壤吸附PAHs的影响作用的内容；2)确定DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响内容；3)确定DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制的内容；Step2、确定研究方案，研究方案包括：(1)PAHs的选取；2)土壤样本的采集；(3)DOM的制备；(4)DOM元素组成分析；5)菌种选取；6)PDA液体培养基制备；7)磨口玻璃柱装置制作；8)静止培养；Step3、方案的实施；Step4、数据采集及数据分析；Step5、得出结论。该研究方法更加详实、具体，使土壤有机物污染分解实验更加规范，同时为土壤污染有机物分解产品的推出提供研究基础。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	云南;53
申请人：	昆明学院
发明人：	林丽;余绍俊;余磊;陈泽斌;徐松萍;曹富美;黄丽;徐胜光
专利状态：	有效
申请号：	CN201810876735.9
公开号：	CN109142677A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350
代理人：	汤东凤
分类号：	G01N33/24(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	650214 云南省昆明市昆明经济技术开发区浦新路2号
主权项：	1.一种DOM影响白腐菌降解PAHs的研究方法，包括以下步骤：Step1、确定研究内容，研究内容包括以下方面：(1)确定DOM对土壤吸附PAHs的影响作用的内容：对模型DOM进行分子量分级，极性、非极性和组分的分离，定量分析土壤在不同条件下、不同培养方式对PAHs的吸附作用，深入研究大分子量的DOM增溶PAHs对土壤吸附的影响过程，探明不同极性、不同分子量、不同组分的DOM对土壤吸附PAHs的影响作用；(2)确定DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响内容：定量研究灭活菌丝和生长菌丝PAHs的吸附‑解吸的动态变化，分析小分子量的DOM作为碳源促进菌丝生长的过程对PAHs的影响作用，以可溶性PAHs为监测指标，进一步研究大分子量的DOM对PAHs的结合增溶过程，通过对过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)、漆酶(Laccase)的定量监测，深入研究代谢降解酶与PAHs之间的动态关系，重点分析降解酶系产生的途径与机理，并监测PAHs降解的中间产物，从而探明DOM促进白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响作用；(3)确定DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制的内容：深入分析土壤吸附、菌丝的吸附‑解吸过程、小分子量的DOM促进菌丝生长、大分子量的DOM的结合增溶、酶代谢降解和PAHs的浓度变化之间的相互关系，深入研究复杂土壤条件下DOM增溶PAHs和促进菌丝生长对土壤降解PAHs的影响作用，重点监测白腐菌降解酶系产生的途径及机理的动力学关系与体系碳、氮源利用规律的关联性，探明降解酶的产生与高产和体系碳、氮的耦合关系，并监测PAHs降解的中间产物，揭示DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制；Step2、确定研究方案，研究方案包括以下方面：(1)、PAHs的选取：选取土壤污染的高环PAHs菲或芘为模型研究物；(2)、土壤样本的采集：采集典型PAHs污染区土壤，测定PAHs的含量；在实验室冷冻干燥，用研钵捣碎研细，过2mm筛备用，此为原土；原土测定颗粒组成、有机质、氮、pH值等指标；称取风干并过2mm筛的原土置于三角瓶中，加入100mL去离子水，200r/min下恒温振荡4h，静止后弃去上清液，重新加入去离子水，重复该过程4次，然后将土样自然风干，磨碎，过2mm筛，作为去除内源DOM的土样；自制室内PAHs污染土壤：将PAHs的乙醇溶液，加入含灭菌土壤的锥形瓶中，放置至乙醇全部挥发完为止；(3)、DOM的制备：采用水浸提法，选用新鲜奶牛粪，作水分校正后与超纯水1：2混合，连续振5h，然后4000r/min离心10min，上清液过0.45μm滤膜，滤液中的有机物即为DOM，其浓度采用TOC仪测定，滤液经电渗析去离子后，40℃旋转蒸发浓缩冻干，磨碎备用；(4)、DOM元素组成分析：用Foss Heraeus CHN‑O‑Rapid型元素分析仪进行元素分析；在750℃温度下灰化4h，称重确定灰分含量；O的含量由总重量减去灰分、碳、氢、氮的重量计算；以除去灰分的纯有机质为基数计算各元素的相对百分含量；用KBr压片法在Nexus 870型红外光谱仪上测定红外光谱；在Bruker DRX500仪器上进行核磁共振测定，1H的共振频率为79.452MHz，DMSO‑d6为溶剂；(5)、菌种选取：白腐菌从云南省微生物研究所购买的Phaner ochaete chrysosporium BKM‑F‑1767(GIM3.383)；在PDA液体培养基里摇床培养4‑5天后作为一级种子，新鲜活菌丝或高温灭活菌丝两种处理；(6)、PDA液体培养基制备:200g/L土豆，煮沸10min后的提取物，20g/L葡萄糖，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO4 3.0g/L；(7)、磨口玻璃柱装置制作：定制长约80cm、内径8cm的玻璃圆筒，两头分别配置密封的磨口玻璃密封盖，管内填满混匀的PAHs污染土壤；(8)、静止培养：将污染土壤放入磨口玻璃柱装置，DOM+白腐菌孢子等待加溶液缓慢从上面入口加入玻璃柱中，不同温度气候箱静止培养，隔一段时间倒置一次，利用端口盖子的开启或密闭来控制氧气量，定期取样监测相关指标；Step3、方案的实施，方案的实施包括以下方面：(1)DOM对土壤吸附PAHs的影响作用：A、DOM的分离、分级：分子量分级(透析法)：将8000Da透析膜(Spectra/Por7，Spec trum Industries，California)剪成所需大小，扎紧一端，系成袋状，置于0.01mol/L CH3COOH中煮沸30min，然后用超纯水洗涤数次；在透析袋中加入10mL DOM溶液，上端扎紧悬挂于铁丝上，置于0.005mol/L K2SO4溶液中透8h(搅动数次)，然后置于超纯水中继续透析32h，间隔搅动，并换3次水，实验在4℃下进行，用差减法确定不同分子量级DOM的含量；极性与非极性DOM的分离：活化树脂：将XAD‑7树脂在0.1mol/L NaOH中浸泡24h后，用超纯水洗涤干净，将XAD‑7装填到玻璃柱(内径2cm，长25cm)中，装填高度为20cm，用30mL 0.1mol/L HCl洗柱，再用超纯水洗至无DOC；组分分离：将10mL调整到pH 2的DOM加入柱中，先用40mL 0.01mol/L HCl洗脱，然后用超纯水洗至无DOC，洗脱液流速为1mL/min，收集洗脱液并测定其中DOC含量，这部分DOM代表亲水性DOM组分，吸附在树脂上的疏水性DOM组分则用差减法求出；B、土壤吸附：不同粒级结构的灭菌污染土壤的不同PAHs浓度，去除内源DOM和未去除内源DOM，9种不同pH值(4.0‑8.0)、6种不同温度(25‑40℃)，加入不同分子量、不同极性、不同组分的DOM的不同的量(5‑50mL)，5种不同水土比，分析DOM对土壤在0‑36h的吸附行为的影响，以未添加DOM作对比，分别设定灭菌土壤、不加土壤和不添加DOM空白，分摇床和静止培养，每隔3h取样，以土壤微生物生物量、水溶液中PAHs浓度、土壤中PAHs的浓度为监测指标，定量研究大分子量的DOM的结合增溶对土壤吸附行为的影响过程，探明不同组分、不同极性、不同分子量的DOM对土壤吸附PAHs的影响作用；(2)DOM对白腐菌生长及其关键酶分泌过程的影响：A.、菌丝的吸附：一定量的灭活菌丝和活菌丝，不同接种量接入不同PAHs浓度的液体培养液中，加入不同分子量、不同极性、不同组分的DOM，设定不加DOM、只加PAHs溶液的液体培养基空白，摇床和静止培养，观察菌丝形态的变化，以水溶液中PAHs的浓度为监测指标，定量研究0‑30dDOM对菌丝吸附‑解吸PAHs的作用过程的影响，探明DOM的增溶对菌丝吸附‑解吸的影响作用。B、促进菌丝生长：将在液体培养基里培养5‑6天生长良好的一级种子，按不同接种量接入含PAHs不同浓度培养基中，不同分子量、不同极性、不同组分的DOM按照一定的浓度梯度添加，以未添加DOM为对照，9种不同pH、6种不同温度，外源N选择脲、酒石酸铵，外源C选择葡萄糖、纤维二糖，控制体系7种不同的C/N，分摇床振荡培养和静置培养，每隔24h取样一次，以生物量、PAHs浓度、Lip、Mnp和Lacca se活性为监测指标，深入研究从接种到检出降解酶活性阶段DOM促进白腐菌生长的作用机制；C、酶代谢降解：一级种子按不同的接种量接入含不同PAHs浓度的的液体培养基中，不同极性、不同接种量、不同分子量的DOM，以未添加DOM的含PAHs培养基接种相同量的一级种子为样品空白，选择相同的氮和碳，外源氮选择脲、酒石酸铵，碳选择葡萄糖、纤维二糖，最适pH、最适温度，培养方式分摇床振荡培养和静止培养，每隔24h取样一次，定量监测生物量、PAHs浓度的变化和Lip、Mnp和Laccase酶活性，研究不同碳氮比和白腐菌的酶代谢降解途径的作用关系，监测Lip、Mnp和Laccase的产生机制和PAHs浓度变化的动态关系，进一步分析PAHs的中间代谢产物，研究PAHs的降解途径，从而探明白腐菌自产酶开始DOM对关键酶分泌过程的影响作用；(3)DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制：基于以上研究结果，深入分析土壤吸附、小分子量DOM促进菌丝生长、大分子量DOM对PAHs的结合增溶、白腐菌菌丝吸附/解吸以及酶代谢降解之间的相互关系，不同分子量、不同极性、不同组分、不同体积的DOM和不同接种量的白腐菌菌丝、不同土壤条件(pH、温度、碳、氮、氧气、灭菌和未灭菌)，不同PAHs浓度，外源氮选择脲、酒石酸铵，碳选择葡萄糖、纤维二糖，控制体系不同7种不同C/N，5种不同水土比，培养方式分摇床振荡培养和静止培养，每隔24h取样一次，检测生物量、氮、碳、PAHs浓度的变化和Lip、Mnp和Lacca se酶活性等指标，分析PAHs的中间代谢产物，研究复杂条件下不同C/N和关键酶产生的途径与机理的耦合关系，探明复杂条件下降解酶高产、稳产的关键因素，揭示DOM促进白腐菌降解土壤PAHs的作用机制；(4)测试方法：木质素过氧化物酶(Lip)采用藜芦醇‑分光光度法，锰过氧化物酶(Mnp)采用愈创木酚‑分光光度法，漆酶(Laccase)用ABTS‑分光光度法；颗粒组成采用吸管法；土壤总有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定；总氮采用开氏定氮法测定；pH用玻璃电极测定(水土比为1:5，仪器型号：上海雷磁ZD‑2，自动电位滴定仪)；菌丝干重用恒重重量法，生物量用平板计数法；土壤相中PAHs和中间产物的抽提测定：将土壤用二氯甲烷超声萃取15min，反复萃取3次，将萃取有机相混合，过滤取澄清上清液旋转蒸发，N2吹定容为1mL，转换溶液为正己烷，过硅胶、氧化铝符合净化柱，依次用20mL正己烷洗去杂质，70mL二氯甲烷/正己烷(3/7，V/V)混合洗脱PAHs，洗脱液再旋转蒸发浓缩至1‑2mL，N2吹浓缩至0.5mL GC‑M测定；进样口温度为250℃，脉冲无分流方式进样，载气为高纯氦气，流量为l.0mL/min，恒流模式；色谱柱：HPS‑Ms(30m×0.25mm，0.25μm；升温程序：初始柱温45℃保持3min，以10℃/min升温至130℃，保持3min，然后以8℃/min升温至300℃，保持5min而后升温至310℃，保持2min；SIM模式，四极杆温度150℃，离子源230℃，气相色谱质谱接口温度230℃，离子化方式EI(电子轰击离子化)，电子轰击能量70eV，电子倍增电压1.4KV，自动调谐，自曝全扫描(SCAN)，质量数扫描范围50～300mu；然后根据各化合物的保留时间与质谱图建立选择粒子检测(SIM)的时间范围与定性、定量离子；选择粒子扫描色谱图将依据以下条件定性：①保留时间范围±1s，信号应大于等于3倍噪声信号；②定性、定量离子峰检测强度的比值应不超过理论值的15％；Step4、数据采集及数据分析；Step5、得出结论。
所属类别：	发明专利