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原文传递一种甲型通用及H7N9亚型流感病毒胶体金联合检测试纸的制备方法

专利名称：	一种甲型通用及H7N9亚型流感病毒胶体金联合检测试纸的制备方法
摘要：	本发明涉及一种甲型通用及H7N9亚型流感病毒胶体金联合检测试纸的制备方法，可有效解决现有检测方法特异性低、敏感性差、费时、繁琐的问题，技术方案是，试纸条装在试纸壳内，试纸条包括样品垫、胶体金垫、反应膜、吸水垫和背衬，背衬上依次固定有样品垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫，反应膜上依次包被有H7N9亚型流感病毒检测线、甲型流感病毒检测线和质控线；试纸壳上有样本孔和检测结果区；其制备方法包括制备样品垫、制备胶体金垫、制备检测线和对照线、组装检测试纸；本发明可在一次检测中同时对甲型流感病毒和H7N9亚型流感病毒进行快速检测，简便、特异、灵敏的快速检测，结果稳定可靠，经济效益和社会效益十分显著。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	陕西;61
申请人：	陕西省人民医院;陕西瑞奇生物科技有限公司
发明人：	胡军;张海祥
专利状态：	有效
申请号：	CN201810997222.3
公开号：	CN109142725A
代理机构：	郑州天阳专利事务所(普通合伙) 41113
代理人：	胡雨薇
分类号：	G01N33/569(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	710068 陕西省西安市碑林区友谊西路256号
主权项：	1.一种甲型通用及H7N9亚型流感病毒胶体金联合检测试纸，包括试纸（10）和试纸条（9），其特征在于，试纸条（9）装在试纸壳（10）内，试纸条（9）包括样品垫（1）、胶体金垫（2）、反应膜（3）、吸水垫（7）和背衬（8），背衬（8）上依次固定有样品垫（1）、胶体金垫（2）、反应膜（3）和吸水垫（7），样品垫（1）的后端扣压在胶体金垫（2）的前端，胶体金垫（2）的后端扣压在反应膜（3）的前端，吸水垫（7）的前端扣压在反应膜（3）的后端，反应膜（3）上依次包被有H7N9亚型流感病毒检测线（4）、甲型流感病毒检测线（5）和质控线（6）；试纸壳（10）上有样本孔（11）和检测结果区（12），样本孔（11）对应于试纸条（9）上的样品垫（1），检测结果区（12）上的T1、T2和C分别与试纸条（9）上的H7N9亚型流感病毒检测线（4）、甲型流感病毒检测线（5）和质控线（6）对应；其制备方法包括以下步骤：（1）制备样品垫所述样品垫（1）包括样品处理液和玻纤膜；每1000mL样品处理液由18‑22g 牛血清白蛋白、4‑6g聚乙二醇辛基苯基醚和0.008‑0.012M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，余量为超纯水制成；玻纤膜裁切成20‑24mm宽，将100μL样品处理液喷涂在0.6‑1.0cm长的玻纤膜上，37℃干燥过夜，得样品垫（1）；（2）制备胶体金垫所述的胶体金垫（2）包括玻纤膜和金标抗体液，玻纤膜裁切成5‑9mm宽，将100μL金标抗体液喷涂在1.0‑2.0 cm长的玻纤膜上，干燥后密闭静置平衡10‑14小时，即得胶体金垫（2）；所述金标抗体液的制备包括： 1）制备胶体金稀释液：每1000mL胶体金稀释液由8‑12g牛血清白蛋白、23‑27g蔗糖、0.4‑0.6g吐温‑20、0.8‑1.2g叠氮钠和0.008‑0.012M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，余量为超纯水制成； 2）制备胶体金颗粒溶液：取质量浓度为0.01%的氯金酸水溶液40‑60mL，加热至煮沸，加入质量浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液550‑650μL，加热至出现酒红色，再加入40‑60mL、4℃预冷的电导率为18.20的纯净水，即得粒径为30nm的胶体金颗粒溶液；胶体金颗粒溶液吸收峰波长为530‑535nm，吸光度值大于0.40； 3）制备胶体金标记抗体：取步骤2）制备的胶体金颗粒溶液8‑12mL，磁力搅拌条件下，加入体积浓度为30%的双氧水溶液30‑35μL；室温磁力搅拌混合8‑12min后，加入0.15‑0.25M的碳酸钾水溶液280‑320μL，室温磁力搅拌8‑12min后，加入0.15‑0.25mg纯化冻干的抗流感病毒单克隆抗体H1‑13；抗流感病毒单克隆抗体H1‑13冻干前缓冲液为0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液；室温磁力搅拌60min后，加入0.08‑0.12g 牛血清白蛋白，室温磁力搅拌混合8‑12min后，加入0.008‑0.012g聚乙二醇6000，室温磁力搅拌混合25‑35min，得金标抗体，将金标抗体移入离心管，在4℃，7000‑9000rpm下离心8‑12min，弃去上清，酒红色沉淀即为胶体金标记抗体； 4）制备金标抗体液：用步骤1）制备的胶体金稀释液稀释步骤3）制备的胶体金标记抗体，至稀释后的金标抗体液在530‑535nm下的吸光度值大于0.40，得金标抗体液；（3）制备检测线和对照线所述的检测线和对照线分别是按每厘米检测线用2μL点膜液，将检测抗体点膜液、对照抗体点膜液喷涂在反应膜上，室温晾干，即成：所述检测抗体点膜液和对照抗体点膜液的制备包括： 1）制备点膜稀释液：所述点膜稀释液是由0.008‑0.012M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，0.15mol/L氯化钠，10mol/L乙二胺四乙酸，1g/L叠氮钠，30g/L的甲醇，其余为超纯水制成； 2）制备检测抗体点膜液：将纯化冻干的抗流感病毒单克隆抗体H7‑50和A1‑6，用点膜稀释液稀释至1.5‑2.5mg/mL；所述抗流感病毒单克隆抗体H7‑50和A1‑6纯度均大于90%，效价大于1:105； 3）制备对照抗体点膜液：将效价大于1:107的山羊抗小鼠多抗用点膜稀释液稀释至0.6‑1.0mg/mL；（4）组装检测试纸首先将反应膜（3）包被上H7N9亚型流感病毒检测线（4）、甲型流感病毒检测线（5）和质控线（6），再固定粘贴到背衬（8）上，将胶体金垫（2）的后端扣压在反应膜（3）的前端，吸水垫（7）的前端扣压在反应膜（3）的后端，样品垫（1）的后端扣压在胶体金垫（2）的前端，将样品垫（1）、胶体金垫（2）、和吸水垫（7）的其余部分固定在背衬（8）上，得试纸条（9）；再将试纸条（9）装在试纸壳10内，试纸壳（10）上的样本孔（11）对应于试纸条（9）上的样品垫（1），检测结果区（12）上的T1、T2和C分别与试纸条（9）上的H7N9亚型流感病毒检测线（4）、甲型流感病毒检测线（5）和质控线（6）对应；即得甲型通用及H7N9亚型流感病毒胶体金检测试纸。
所属类别：	发明专利