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原文传递一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法

专利名称：	一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法
摘要：	本发明涉及文物检测领域，公开了一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法，本发明首先采用非传统方法将古遗址中蚕丝蛋白微痕迹提出，然后利用非传统的Western Bolt技术进行古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的检测，利用特异性强的抗桑蚕丝素蛋白抗体，完成对样品的检测。本发明一方面优化了古遗址中蚕丝蛋白的提取，另一方面加大了所提取出的蚕丝蛋白浓度及检测信号，除此之外，采用“抗原抗”类似三明治结构技术，避免了因抗原浓度不足导致的假阴性结果，同时也提高了抗原与抗体的结合几率。方法简便，结果准确，本发明为分析古遗址中蚕丝蛋白微痕迹提供了明确的指导方向。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江理工大学
发明人：	古锦翠;王秉;尚亚廷;徐城锋
专利状态：	有效
申请号：	CN201811336715.9
公开号：	CN109283332A
代理机构：	杭州永航联科专利代理有限公司 33304
代理人：	侯兰玉
分类号：	G01N33/561(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310018 浙江省杭州市江干区下沙高教园区2号大街浙江理工大学
主权项：	1.一种基于Western Bolt测定古遗址中蚕丝蛋白微痕迹的方法，其特征在于包括以下步骤：1)取2.5‑3.5mg古遗址中蚕丝蛋白微痕迹，用乙醇水溶液对其常温浸泡25‑35min，然后离心处理，移去上清液，下层物质于通风处晾干；2)向晾干后的样品中加入100‑200μL的RIPA裂解液，震荡混匀，在60‑70℃下裂解10‑20min，期间震荡3‑5次；3)充分裂解后，向溶液中加入4‑6wt％的NaCl溶液100‑150μL，于‑25℃至‑15℃下静置8‑12min析出蚕丝蛋白，离心处理；4)移上清液到另一离心管中，重复步骤3)至少两次，然后用乙醇水溶液分别洗涤多次离心后所得的蛋白沉淀，震荡均匀后将多个离心管内样品合为一管，离心处理，移去上清液，通风晾干；5)向步骤4)所得蛋白沉淀中加入1‑2μL的DNA酶，1‑2μL的RNA酶以及35‑45μL体积比为1∶7‑9∶1‑3的CaCl2∶H2O∶ethanol溶液，于60‑70℃孵育8‑12min，获得蚕丝蛋白微痕迹溶液；6)按重量比1∶1‑2向蚕丝蛋白微痕迹溶液中加入叠氮化合物缓冲液，在1‑5℃下轻微震荡过夜，得到叠氮化合物标记的蚕丝蛋白；7)在1mL的PBS缓冲液中加入1mg的NHS‑三芳基膦，0.5mL的N，N‑二甲基甲酰胺和20mg的HRP标记的羊抗兔抗体，将所得混合物室温震荡1‑3h，然后过30kDa截留分子量的柱纯化，获得三芳基膦标记与HRP标记的羊抗兔抗体；8)采用TGX快速免染制胶试剂盒制备SDS‑PAGE凝胶；对抗桑蚕丝素蛋白抗体进行跑电泳测试，使用4‑6μL未染marker作为蛋白分子量标准物，在浓缩胶中控制电压80v，在分离胶中控制电压120v，待溴酚蓝前沿到达凝胶底部停止电泳，在化学发光成像仪中可观察电泳结果；紧接着将电泳分离之后的抗体在300mA、冰水浴条件下50‑70min转印到聚偏氟乙烯膜上，在化学发光成像仪中可观察转印结果；在室温摇床上使用20‑30mL的0.4‑0.6wt％的脱脂奶粉溶液封闭聚偏氟乙烯膜上的非特异性结合点，封闭时间控制在1‑2h；待封闭结束后，使用步骤5)所获得的蚕丝蛋白微痕迹溶液点到聚偏氟乙烯膜上并室温孵育1‑2h，使用标准的蚕丝蛋白溶液作为阳性对照，缓冲液作为阴性对照；孵育结束后，使用缓冲液洗涤2‑4次，每次4‑6min，紧接着加入20‑30mL的三芳基膦标记与HRP标记的羊抗兔抗体，保持在室温摇床上孵育1‑2h，然后再次使用缓冲液洗涤2‑4次，避光向聚偏氟乙烯膜上加入0.8‑1.2mL显色液，反应4‑6min后移至化学发光成像仪中观察免疫结果；若检测到条带则证实所提取的样品由桑蚕丝制作而成，若没有检测到条带则说明所提取的样品不是由桑蚕丝制作而成。
所属类别：	发明专利