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原文传递一种检测卡那霉素的均相生物传感方法及其应用

专利名称：	一种检测卡那霉素的均相生物传感方法及其应用
摘要：	一种检测卡那霉素的均相生物传感方法及其应用，通过G‑四链体DNA（S1）与卡那霉素核酸适配体（S2）的双链杂交反应抑制DNA酶活性，而卡那霉素与其核酸适配体之间的特异性结合释放对应数量的S1，并结合氯化血红素形成DNA酶进行催化显色信号转导；此外，卡那霉素与其核酸适配体之间形成的发夹结构可以在引入互补链S3杂交之后，通过核酸外切酶III的催化目标分析物循环来提高方法的灵敏度；利用核酸适配体特异性识别释放的DNA酶的催化显色反应，构建显色产物吸光度与卡那霉素分析物浓度之间的定量关系；本发明操作方便，成本低廉，灵敏度高，稳定性好，对于食品、水体等复杂介质中卡那霉素残留的快速检测具有很好应用价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	湖北师范大学
发明人：	赖国松;陈志超
专利状态：	有效
申请号：	CN201811099210.5
公开号：	CN109283147A
代理机构：	黄石市三益专利商标事务所 42109
代理人：	林晓珍
分类号：	G01N21/31(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	435000 湖北省黄石市磁湖路11号
主权项：	1.一种检测卡那霉素的均相生物传感方法，其特征在于包括以下步骤：（1）G‑四链体特征序列与卡那霉素核酸适配体杂交双链制备向PV管中加入990µL浓度为10mM pH=7.4 三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有200mM NaCl、10mM KCl、质量分数为1% DMSO和质量分数为0.05% Triton X‑100，再向其中加入5µL 10µM G‑四链体DNA链和5µL 10µM 卡那霉素核酸适配体溶液，所述G‑四链体DNA链的碱基序列为5’‑GGG TAG GGC GGG TTG GGA ACC TCA AGA CCA CTT GGA CAT TTT‑3’，所述卡那霉素核酸适配体的碱基序列为5’‑TGT CCA AGT GGT CTT GAG GTT TTTT‑3’，室温震荡反应45min后得到适配体杂交双链复合物溶液待用；（2）均相反应测定标准溶液中卡那霉素的含量取6份上述适配体杂交双链复合物溶液各100µL，向其中分别加入含有卡拉霉素的浓度梯度为0.0001ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL和10ng/mL 20mM pH=7.4 Tris‑HCl缓冲溶液50µL，该缓冲溶液中含有100mM NaCl，2mM MgCl2和5mM KCl，再向每份溶液中加入5µL 2µM 卡那霉素核酸适配体部分互补序列、5µL 5U/µL核酸外切酶III以及5µL 1µM的氯化血红素，所述卡那霉素核酸适配体部分互补序列中的碱基序列为5’‑AAA AAA CCT GAC ACT AC‑3’；37℃涡旋混匀反应70min后，升高温度至65℃，保持5min后降至25℃；接着向每份溶液中加入70µL含有0.4mM TMB、0.4mM H2O2的pH=5.0柠檬酸盐缓冲溶液，该缓冲溶液中含有95.8mM Na2HPO4、52.1mM柠檬酸钠和40mM KCl，显色反应5min之后，继续向其中加入30µL 2M H2SO4终止显色反应；利用紫外‑可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系；（3）样品中卡那霉素含量的检测取适量的样品并进行前处理，取处理后的样品溶液50µL，向其中加入100µL适配体杂交双链复合物溶液、5µL 2µM 卡那霉素核酸适配体部分互补序列、5µL 5U/µL核酸外切酶III以及5µL 1µM的氯化血红素，所述卡那霉素核酸适配体部分互补序列中的碱基序列为5’‑AAA AAA CCT GAC ACT AC‑3’；37℃涡旋混匀反应70min后，升高温度至65℃，保持5min后降至25℃；接着向样品溶液中加入70µL含有0.4mM TMB和0.4mM H2O2的pH=5.0柠檬酸盐缓溶液，该缓冲溶液中含有95.8mM Na2HPO4、52.1mM柠檬酸钠和40mM KCl，显色反应5min之后，继续向其中加入30µL 2M H2SO4终止显色反应；利用紫外‑可见分光光度计测定样品溶液的吸光度值，根据吸光度与卡那霉素浓度之间的定量关系计算卡那霉素的含量。
所属类别：	发明专利