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测定14-3-3蛋白与质膜H+-ATPase蛋白互作的电化学方法
| 专利名称： | 测定14-3-3蛋白与质膜H+-ATPase蛋白互作的电化学方法 |
| 摘要： | 本发明公开了一种测定14‑3‑3蛋白与质膜H+‑ATPase蛋白互作的电化学方法，选用导电性良好的丝网印刷电极，将捕获探针质膜H+‑ATPase抗体通过物理吸附固定在丝网印刷电极的工作电极上，待检测的蛋白复合物中的14‑3‑3蛋白和信号探针结合反应后，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素与信号探针连接在印刷电极表面，利用电化学分析仪检测辣根过氧化物酶催化底物的氧化还原电流实现检测；利用本电化学方法可快速实现14‑3‑3蛋白与质膜H+‑ATPase蛋白互作的高灵敏度检测；该检测方法具有灵敏度高，价格低廉，检测速度快等优点，可用于14‑3‑3蛋白与质膜H+‑ATPase蛋白互作的检测。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 云南;53 |
| 申请人： | 昆明理工大学 |
| 发明人： | 陈丽梅;曹文佳;郭传龙;周磊 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请号： | CN201811182878.6 |
| 公开号： | CN109470756A |
| 分类号： | G01N27/327(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N27 |
| 申请人地址： | 650093 云南省昆明市五华区学府路253号 |
| 主权项： | 1.一种测定14‑3‑3蛋白与质膜H+‑ATPase蛋白互作的电化学方法，其特征在于包括以下步骤 ：（1）对丝网印刷电极上的工作电极进行活化，使工作电极表面产生羧基；（2）在步骤（1）活化后的丝网印刷电极的工作电极上滴加14‑3‑3蛋白抗体液， 4℃结合5～20h后，用电极洗液冲洗工作电极3～4次，烘干；再滴加牛血清白蛋白液封闭活性位点，室温封闭0.5h～2h，电极洗液冲洗工作电极3～4次，烘干；（3）在步骤（2）烘干的多个工作电极上滴加5μL浓度在0μg/mL～12μg/mL范围内的14‑3‑3蛋白液，结合1～2h后电极洗液冲洗工作电极，烘干；（4）在工作电极上滴加生物素标记的Biotin‑14‑3‑3抗体液，结合1～2h后电极洗液冲洗工作电极，烘干；（5）在工作电极上滴加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素溶液，室温反应10～60min，用电极洗液进行清洗，在丝网印刷电极上滴加3,3',5,5'‑四甲基联苯胺水溶液，然后在电化学分析仪上采用循环伏安法和电流‑时间曲线法测定电流大小， 以14‑3‑3蛋白含量和对应的电流值，制作工作曲线，得到线性回归方程；（6）在步骤（1）活化后的丝网印刷电极的工作电极上滴加质膜H+‑ATPase抗体液，作为捕获探针，4℃结合5～20h后，后续操作同步骤（2），该步骤制得的工作电极即为电化学传感器；在电化学传感器上滴加从植物根部提取的待检测物，结合1～2h后电极洗液冲洗电化学传感器，以洗去非特异性结合的杂蛋白；在电化学传感器上滴加生物素标记的Biotin‑14‑3‑3抗体，作为信号探针，结合1～2h后电极洗液冲洗电化学传感器，烘干；按步骤（5）方法测定电流大小，将测得的电流值带入线性回归方程中，获得与质膜H+‑ATPase结合的14‑3‑3蛋白的量，进而分析质膜H+‑ATPase与14‑3‑3蛋白的互作关系。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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