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原文传递基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法

专利名称：	基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法
摘要：	本发明公开基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，将目标基因分别构建到表达载体的N端，提质粒后转化农杆菌，制备农杆菌侵染液共注射模式植物，提取共注射烟草叶片蛋白，用GFP‑Trap A beads去富集带有GFP标签的目标蛋白，同时将带有mCherry标签的其他目标蛋白免疫下来，最后分别使用GFP和mCherry标签抗体检测目标蛋白在免疫前和免疫后的表达及互作情况。本发明在实现荧光可视化实时监控目标蛋白在活细胞内表达及共定位的同时，可实时选择表达量最高的时期直接进行免疫共沉淀高效验证蛋白互作，极大提高蛋白互作验证的成功率，大幅度降低时间和经济成本。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏省农业科学院
发明人：	付健美;施雨;纪锐;方继朝
专利状态：	有效
申请日期：	2019-09-02T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910825400.9
公开号：	CN110456075A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	王艳
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	210014江苏省南京市玄武区钟灵街50号
主权项：	1.基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）分别构建含有待验证互作目标基因的载体：将两个或两个以上待验证互作的目的基因分别同源重组到表达载体pBinplus-GFP和/或pBinplus-mCherry的N端，提取质粒后分别转化农杆菌； 2）将步骤1）得到的两个或两个以上的农杆菌混合制备农杆菌侵染液共注射模式植物； 3）提取步骤2）共注射模式植物叶片蛋白获得蛋白粗提液，用GFP-Trap A beads去富集蛋白粗提液中带有GFP标签的目标蛋白，同时将带有mCherry标签的其它目标蛋白免疫下来，最后分别使用GFP和mCherry荧光标签抗体检测两种或两种以上的目标蛋白在免疫前和免疫后的表达及互作情况。 2.根据权利要求1所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述步骤1）的两个或两个以上的待验证互作目的基因为cry1Ab/c基因、CAMTAs、DAHP、 HKMTs基因中的任意两种或两种以上。 3.根据权利要求1所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述步骤1）的农杆菌为根癌农杆菌GV3101。 4.根据权利要求1所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述步骤2）的农杆菌侵染液的制备步骤为：将步骤1）得到的农杆菌分别在含有相应抗生素的LB培养基中培养48h得到两种或两种以上菌液离心弃上清得到菌体，用瞬时侵染液悬浮菌体得到两种或两种以上农杆菌侵染液，将所述两种或两种以上的农杆菌侵染液OD600值分别均调到1.0~1.2，等体积混匀备用。 5.根据权利要求1所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述步骤2）中的农杆菌浸染液中还包括沉默抑制子P19。 6.根据权利要求1所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述步骤2）的模式植物为烟草叶片。 7.根据权利要求1所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述步骤3）共注射模式植物叶片蛋白的提取步骤为：称取植物组织，用锡箔纸包好，在液氮中挤压成小碎片后倒入已预冷的研钵中或直接用液氮研磨成粉末，加入extraction buffer，研磨直到变成匀浆；加入预冷的20%Triton，继续研磨；用移液枪转移至预冷的EP管中，迅速用涡旋仪充分混匀，置于冰上，然后放置于预冷摇床上摇，离心，取上清转移至新的EP管中，离心，上清液即为蛋白粗提液。 8.根据权利要求7所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述extraction buffer包括DTT、1×蛋白酶抑制剂和TNEG缓冲液，所述TNEG缓冲液组分包括50mM Tris、150mM NaCl，0.5mM EDTA和8%甘油。 9.根据权利要求7所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述步骤3）中还包括用IP buffer清洗GFP-Trap A beads步骤，所述IP buffer的组成为：20%Triton、DTT和TNEG缓冲液。 10.根据权利要求7所述的基于双色荧光标签蛋白GFP和mCherry进行免疫共沉淀检测蛋白互作的方法，其特征在于，所述GFP荧光标签抗体浓度为1:4000，mCherry荧光标签抗体浓度为1:1000。
所属类别：	发明专利