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原文传递一种测定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白生物学活性的新方法

专利名称：	一种测定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白生物学活性的新方法
摘要：	本发明涉及一种测定重组人可溶性gp130‑Fc融合蛋白生物学活性的新方法。所述方法利用SIE萤光素酶报告基因质粒，转染CHO‑K1细胞后加压筛选获得稳定表达SIE萤光素酶的单克隆细胞株。利用IL‑6/sIL‑6Rα复合物刺激激活SIE反应元件下游萤光素酶报告基因表达，可溶性gp130‑Fc融合蛋白竞争性结合IL‑6/sIL‑6Rα复合物，剂量依赖性抑制萤光素酶表达，加入萤光素酶底物后，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定重组人可溶性gp130‑Fc融合蛋白的生物学活性。本发明针对重组人可溶性gp130‑Fc融合蛋白的生物学活性建立了快速准确的检测方法，避免了细胞培养的不确定性所带来的不稳定因素和长时间孵育所带来的细胞污染等可能出现的问题。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国食品药品检定研究院
发明人：	王军志;饶春明;于雷;贾春翠;周勇;姚文荣;史新昌;秦玺;裴德宁
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-21T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910420569.6
公开号：	CN110133241A
代理机构：	北京中知法苑知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	常玉明;张兰海
分类号：	G01N33/50(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100050 北京市东城区天坛西里2号
主权项：	1.一种测定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白生物学活性的新方法,其特征在于：所述方法利用SIE萤光素酶报告基因质粒，转染CHO-K1细胞后获得稳定表达SIE萤光素酶报告基因的细胞株，利用IL-6/sIL-6α复合物刺激激活SIE反应元件下游萤光素酶报告基因表达，加入sgp130-Fc后反式信号通路被阻断，抑制萤光素酶报告基因表达；根据测定的萤光信号值拟合四参数曲线确定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白的生物学活性。 2.一种测定重组人可溶性gp130-Fc融合蛋白生物学活性的新方法，其特征在于：所述方法包括： (1)将含SIE萤光素酶的质粒转入细胞，加压筛选，获得稳定表达的单克隆细胞株； (2)将sgp130-Fc融合蛋白药物进行系列稀释，与IL-6/sIL-6Rα复合物37℃孵育1h后，加入至(1)细胞中，37℃刺激7h； (3)弃去上述(2)中的培养液，加入萤光素酶底物测定化学发光值，拟合四参数曲线，根据IC50值确定sgp130-Fc融合蛋白的相对生物学活性。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：其中稳定表达SIE报告基因的效应细胞选择CHO-K1细胞。 4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：其中报告基因为luciferase萤光素酶。 5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于： (1)制备细胞悬液采用含10％血清的F12K培养基； (2)铺板细胞数量为2×104－4×104个/孔，优选3×104个/孔； (3)IL-6浓度为5μg/mL,sIL-6 Rα浓度为2.5μg/mL，sgp130-Fc的预稀释浓度为25000ng/mL,2倍比稀释8个浓度； (4)sgp130-Fc与IL-6/sIL-6 Rα复合物的预孵育条件为37度0.5-2小时，优选为1小时。加入药物刺激时间为5－10小时，优选为7小时； (5)使用萤光素酶底物试剂盒检测化学发光值，可以使用的试剂盒有promega公司的Bright-G1o、Biovision公司的luciferase、PerkinElmer公司的Britelite plus，优选为Bright-G1o； (6)使用酶标仪读取化学发光值，通过拟合四参数曲线确定sgp130-Fc融合蛋白和参比品的IC50值，以相对生物学活性(相对生物学活性＝参比品IC50/样品IC50)反映sgp130-Fc融合蛋白的生物学活性。 6.权利要求1-5所述方法用于sgp130-Fc融合蛋白药物生产和研发中的质量控制。
所属类别：	发明专利