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原文传递基于cAMP的促卵泡激素体外生物学活性测定方法

专利名称：	基于cAMP的促卵泡激素体外生物学活性测定方法
摘要：	本公开涉及基于cAMP的促卵泡激素体外生物学活性测定方法，所述方法包括：(1)构建得到稳定表达FSHR‑荧光蛋白报告基因的效应细胞；(2)培养效应细胞，然后加入FSH蛋白样品并继续培养；(3)将细胞裂解后，根据测定的细胞裂解液中的cAMP含量进行拟合以确定FSH生物学活性。本公开通过构建稳定表达FSHR‑荧光蛋白报告基因的效应细胞，根据测定的细胞裂解液中的cAMP含量，能够有效地应用于重组pFSH‑Fc融合蛋白体外生物学活性的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	宁波三生生物科技股份有限公司
发明人：	梅彩英;周立明;曹锴;吕洁婷;王爱珂;陈璐;范禄同
专利状态：	有效
申请日期：	2022-08-01T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-17T00:00:00+0800
申请号：	CN202210917474.7
公开号：	CN117074703A
代理机构：	北京植众德本知识产权代理有限公司
代理人：	张彦彦
分类号：	G01N33/76;G01N33/543;G01N33/533;G01N33/68;C12Q1/02;G;C;G01;C12;G01N;C12Q;G01N33;C12Q1;G01N33/76;G01N33/543;G01N33/533;G01N33/68;C12Q1/02
申请人地址：	315171 浙江省宁波市海曙区望春工业园区布政东路159号
主权项：	1.一种测定FSH生物学活性的方法，所述方法包括： (1)构建得到稳定表达FSHR-报告基因的效应细胞；优选地，所述报告基因为荧光蛋白报告基因； (2)培养效应细胞，然后加入FSH蛋白样品并继续培养； (3)将细胞裂解后，根据测定的细胞裂解液中的cAMP含量进行拟合以确定FSH生物学活性；优选地，所述拟合为四参数拟合。 2.权利要求1所述的方法，其中所述FSHR-荧光蛋白报告基因为将目的基因FSHR与荧光蛋白基因之间插入2A肽序列形成的报告基因；优选地，所述荧光蛋白选自eGFP、GFP、mWasabi、AcGFP、EBFP、EBFP2、mtagBFP、ECFP、EYFP、venus、tdTomato或TagRFP；更优选地，所述荧光蛋白为eGFP；优选地，所述荧光蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:3或其任何变体所示；优选地，所述荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或其任何变体所示；更优选地，所述报告基因的核酸序列如SEQ ID NO:4或其任何变体所示；更优选地，所述报告基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:8或其任何变体所示。 3.权利要求2所述的方法，其中所述2A肽选自P2A、T2A、E2A或F2A中的任一种；更优选地，所述2A肽为P2A；优选地，所述2A肽的核酸序列如SEQ ID NO:2或其任何变体所示；优选地，所述2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或其任何变体所示。 4.权利要求1-3任一项所述的方法，所述FSHR基因为猪FSHR；优选地，所述猪FSHR的核酸序列如SEQ ID NO:1或其任何变体所示；优选地，所述猪FSHR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或其任何变体所示。 5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中稳定表达FSHR-荧光蛋白报告基因的效应细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、293细胞、3T3细胞、TF-1细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞、549A细胞中的任一种；优选地，所述效应细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述步骤(1)包括：用包含所述FSHR-荧光蛋白报告基因的质粒转染效应细胞；优选地，所述质粒为pcDNA3.1质粒。 7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述步骤(1)包括：对质粒转染后的效应细胞进行G418加压筛选、单克隆筛选和荧光强度筛选；优选地，G418的浓度为500μg/mL。 8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述步骤(2)包括：培养效应细胞；优选地，将所述效应细胞用完全培养基稀释至1E6个/mL，100μL/孔培养过夜。 9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述步骤(2)进一步包括：将FSH蛋白样品用分析培养基稀释至1.28ng/mL-100μg/mL；优选地，所述步骤(2)进一步包括：将加入了稀释后的FSH蛋白样品的效应细胞继续培养4h。 10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述步骤(3)包括：使用cAMP检测试剂盒检测cAMP含量；优选地，使用R&D systems公司的cAMP检测试剂盒。
所属类别：	发明专利