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原文传递用于测量肉毒杆菌神经毒素活性的体外和基于细胞的测定

专利名称：	用于测量肉毒杆菌神经毒素活性的体外和基于细胞的测定
摘要：	本文公开了用于检测和表征神经毒素例如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)或破伤风神经毒素的方法。本公开提供了用于在体外和体内确定神经毒素的效力和活性的方法。还公开了包含报告蛋白的N‑和C‑末端片段的多肽，所述片段通过包含神经毒素切割位点的接头来分开。神经毒素对接头的切割降低了报告蛋白的活性，从而表明神经毒素的活性。还公开了组合物和试剂盒，其包含：所公开的多肽、包含编码这些多肽的核苷酸序列的核酸和表达这些多肽的细胞。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	美国;US
申请人：	哈佛大学校长及研究员协会
发明人：	董民;于非凡
专利状态：	有效
申请日期：	2017-10-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201780077166.5
公开号：	CN110088624A
代理机构：	北京信慧永光知识产权代理有限责任公司
代理人：	王芬;杨国强
分类号：	G01N33/542(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	美国马萨诸塞州
主权项：	1.一种单链多肽，其从N-末端到C-末端包含： a.报告蛋白的N-末端片段； b.包含神经毒素切割位点的接头；和 c.所述报告蛋白的C-末端片段；其中所述N-末端和C-末端片段共同包含功能性报告蛋白序列；并且其中所述接头在功能上连接所述N-末端片段和C-末端片段以产生功能性报告融合蛋白。 2.如权利要求1所述的单链多肽，其中所述报告蛋白是荧光素酶蛋白。 3.一种单链多肽，其包含： a.N-末端结构域，其包含与SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有至少90％列同一性的序列(N-nano1-159)； b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包含神经毒素切割位点；和 c.位于所述接头的C-末端的C-末端结构域，其具有与SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸160-170至少90％序列同一性的序列(C-nano160-170)；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。 4.一种单链多肽，其包含： a.N-末端结构域，其包含相对于SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸1-159具有少于10个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列(N-nano1-159)； b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包含神经毒素切割位点；和 c.位于所述接头的C-末端的C-末端结构域，其相对于SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸160-170，具有少于3个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列(C-nano160-170)；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。 5.如权利要求3-4中任一项所述的单链多肽，其中所述N-末端结构域具有SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸1-159的序列(N-nano1-159)并且所述C-末端结构域具有SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸160-170的序列(C-nano160-170)。 6.如权利要求1-5中任一项所述的单链多肽，其中所述神经毒素切割位点是肉毒芽孢梭菌神经毒素(BoNT)和/或破伤风神经毒素切割位点。 7.如权利要求1-6中任一项所述的单链多肽，其中所述接头还包含位于所述BoNT切割位点与所述N-末端片段或结构域之间，位于所述神经毒素切割位点与所述C-末端片段或结构域之间，或其组合的一个或多个间隔区。 8.如权利要求1-7中任一项所述的单链多肽，其中所述接头还包含BoNT和/或破伤风神经毒素的受体的结合片段。 9.如权利要求8所述的单链多肽，其中所述结合片段位于所述N-末端片段或结构域与所述BoNT切割位点之间。 10.如权利要求8-9中任一项所述的单链多肽，其中所述接头还包含位于所述结合片段与所述BoNT切割位点之间的间隔区。 11.如权利要求1-10中任一项所述的单链多肽，其中至少一个间隔区由甘氨酸和丝氨酸组成。 12.如权利要求1-11中任一项所述的单链多肽，其中至少一个间隔区是5至15个氨基酸。 13.如权利要求1-12中任一项所述的单链多肽，其中至少一个间隔区选自SEQ ID NO：4-9。 14.如权利要求6-13中任一项所述的单链多肽，其中所述BoNT是A、E、C、B、D、F或G。 15.如权利要求6-14中任一项所述的单链多肽，其中所述BoNT切割位点来自SNARE蛋白。 16.如权利要求15所述的单链多肽，其中所述SNARE蛋白是SNAP-25、突触小泡蛋白(VAMP)或突触融合蛋白。 17.如权利要求6-16中任一项所述的单链多肽，其中所述BoNT切割位点是人SNAP-25b的氨基酸141-206。 18.如权利要求6-16中任一项所述的单链多肽，其中所述BoNT切割位点是人VAMP1的氨基酸35-96。 19.如权利要求8-17中任一项所述的单链多肽，其中所述受体是人SV2C。 20.如权利要求19所述的单链多肽，其中所述结合片段是人SV2C的氨基酸529-566，或与人SV2C的氨基酸529-566具有至少90％同一性的序列，或相对于人SV2C的氨基酸529-566，具有不超过10个氨基酸残基取代、缺失或添加的序列。 21.如权利要求1-20中任一项所述的单链多肽，还包含多组氨酸亲和标签。 22.如权利要求21所述的单链多肽，其中所述多组氨酸亲和标签位于所述多肽的C-末端。 23.如权利要求1-22中任一项所述的单链多肽，其中所述接头还包含位于所述N-末端片段或结构域与所述BoNT切割位点之间的完整第二荧光素酶多肽。 24.如权利要求23所述的单链多肽，其中所述第二荧光素酶多肽是萤火虫荧光素酶(例如，北美萤火虫)，细菌荧光素酶(例如，费氏弧菌，哈维氏弧菌)，海肾萤光素酶(海洋腔肠)，甲藻萤光素酶，长腹水蚤荧光素酶或桡足类荧光素酶。 25.如权利要求23或24所述的单链多肽，其中所述接头还包含位于所述第二荧光素酶多肽与所述BoNT切割位点之间的间隔区。 26.如权利要求25所述的单链多肽，其中所述间隔区为5至15个氨基酸。 27.如权利要求25或26所述的单链多肽，其中所述间隔区是GSSGGGGSGGGGSSG(SEQ IDNO：4)，GSSGGGGSGGGSSG(SEQ ID NO：5)或GGGGS(SEQ ID NO：6)。 28.一种单链多肽，其包含： a.SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)； b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包括： i.5至15个氨基酸的第一间隔区； ii.位于所述第一间隔区的C-末端的结合片段，其由SV2C的氨基酸529-566组成； iii.位于所述结合片段的C-末端的第二间隔区； iv.位于所述第二间隔区的C-末端的BoNT切割位点，其包含人SNAP25b的氨基酸141-206； v.5至15个氨基酸的第三间隔区，其位于所述BoNT切割位点的C-末端；和 c.SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170)，其位于所述接头的C-末端；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。 29.一种单链多肽，其包含： a.SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)； b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包括： i.5至15个氨基酸的第一间隔区； ii.位于所述第一间隔区的C-末端的BoNT切割位点，其包含人SNAP25b的氨基酸141-206； iii.5至15个氨基酸的第二间隔区，其位于所述BoNT切割位点的C-末端；和 c.SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170)，其位于所述接头的C-末端；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。 30.一种单链多肽，其包含： a.SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)； b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包括： i.5至15个氨基酸的第一间隔区； ii.位于所述第一间隔区的C-末端的BoNT切割位点，其包含人VAMP1的氨基酸35-96； iii.5至15个氨基酸的第二间隔区，其位于所述BoNT切割位点的C-末端；和 c.SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170)，其位于所述接头的C-末端；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。 31.一种单链多肽，其包含： a.SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)； b.位于N-nano1-159的C-末端的接头，其包括： i.第二功能性荧光素酶多肽； ii.5至15个氨基酸的第一间隔区，其位于所述第二荧光素酶多肽的C-末端； iii.位于所述第一间隔区的C-末端的BoNT切割位点，其包含人SNAP25b的氨基酸1-206； iv.5至15个氨基酸的第二间隔区，其位于所述BoNT切割位点的C-末端；和 c.SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170)，其位于所述接头的C-末端；其中所述接头在功能上连接所述N-nano1-159和所述C-nano160-170以产生功能性荧光素酶融合蛋白。 32.如权利要求28-31中任一项所述的单链多肽，其中一个或多个间隔区是GSSGGGGSGGGGSSG(SEQ ID NO：4)，GSSGGGGSGGGSSG(SEQ ID NO：5)或GGGGS(SEQ ID NO：6)。 33.如权利要求28-32中任一项所述的单链多肽，其进一步包含位于所述C-末端的His6序列(SEQ ID NO：12)。 34.一种核酸，其包含编码如权利要求1-33中任一项所述的单链多肽的核苷酸序列。 35.一种核酸载体，其包含如权利要求34所述的核酸。 36.如权利要求35所述的核酸载体，其为表达载体，并且包含可表达形式的核酸序列。 37.如权利要求36所述的核酸载体，其选自由以下组成的组：病毒表达载体、原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物表达载体。 38.一种细胞，其包含如权利要求34所述的核酸或如权利要求35-37所述的核酸载体。 39.如权利要求38所述的细胞，其表达如权利要求1-33中任一项所述的单链多肽。 40.如权利要求39所述的细胞，其为原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。 41.一种测定肉毒杆菌神经毒素的效力的方法，其包括： a)在适合于BoNT活性的条件下，使所述神经毒素与如权利要求1-33中任一项所述的单链多肽接触；和 b)与参考相比，确定所述多肽的荧光素酶活性，从而确定所述效力。 42.一种检测样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(BoNT)活性的方法，其包括： a)在适合于BoNT活性的条件下，使所述样品与如权利要求1-33中任一项所述的单链多肽接触；和 b)与不存在所述样品时的所述多肽的荧光素酶活性相比，确定所述多肽的荧光素酶活性，其中荧光素酶活性的降低表明所述样品中的BoNT活性。 43.如权利要求41-42中任一项所述的方法，其在体外进行。 44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中接触在50mM HEPES，20μM ZnCl2，2mMDTT，1mg/ml BSA，pH7.1的缓冲液中发生。 45.如权利要求41-44所述的方法，其中与所述样品接触的所述单链多肽的浓度为约30nM至300nM。 46.如权利要求45所述的方法，其中与所述样品接触的单链多肽的浓度为约30nM。 47.如权利要求41-46中任一项所述的方法，其中通过向所述单链多肽添加荧光素酶底物并且定量测量所产生的发光信号来确定所述荧光素酶活性。 48.如权利要求41-47中任一项所述的方法，其中所述条件包括在约37℃下孵育约1小时至约36小时的时间。 49.如权利要求41-48中任一项所述的方法，其中所述条件包括在约37℃下孵育约1小时至约24小时的时间。 50.如权利要求41-49中任一项所述的方法，其中所述条件包括在约37℃下孵育约4小时至约24小时的时间。 51.如权利要求41-50中任一项所述的方法，其中所述接头包含5至15个氨基酸的第一间隔区，位于所述第一间隔区的C-末端和所述BoNT切割位点的N-末端的人SV2C的氨基酸529-566的结合片段，和位于所述BoNT切割位点的C-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中所述BoNT切割位点包含人SNAP25的氨基酸141-206。 52.如权利要求41-50中任一项所述的方法，其中所述接头包含位于所述BoNT切割位点的N-末端的5至15个氨基酸的第一间隔区，和位于所述BoNT切割位点的C-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中所述BoNT切割位点包含人SNAP25的氨基酸141-206。 53.如权利要求41-50中任一项所述的方法，其中所述接头包含位于所述BoNT切割位点的N-末端的5至15个氨基酸的第一间隔区，位于所述BoNT切割位点的C-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中所述BoNT切割位点包含人VAMP1的氨基酸35-96。 54.如权利要求41-53中任一项所述的方法，其中所述单链多肽由神经元细胞表达，并且所述方法还包括在所述接触步骤后：将所述神经元细胞孵育约12小时至约60小时的时间，并从所述神经元细胞中收获裂解物。 55.一种检测样品中的肉毒芽孢梭菌神经毒素(BoNT)活性的方法，其包括： a)使所述样品与表达单链多肽的神经元细胞接触，所述单链多肽包含： SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸1-159(N-nano1-159)，SEQ ID NO：1的荧光素酶的氨基酸160-170(C-nano160-170，其通过接头来分离和功能性连接，所述接头包含BoNT切割位点，位于N-nano1-159的C-末端和C-nano160-170的N-末端； b)将所述神经元细胞孵育约12小时至约60小时的时间； c)从所述神经元细胞中收获裂解物； d)与不存在所述样品时的相同处理的神经元细胞中的荧光素酶活性相比，测量所述裂解物中的荧光素酶活性，其中所述荧光素酶活性的降低表明所述样品中的BoNT活性。 56.如权利要求41-55中任一项所述的方法，其中所述接头还包含位于所述N-nano1-159与所述切割位点之间的完整第二荧光素酶多肽。 57.如权利要求56所述的方法，其中所述第二荧光素酶多肽萤火虫荧光素酶(北美萤火虫)，细菌荧光素酶(费氏弧菌，哈维氏弧菌)，海肾萤光素酶(海洋腔肠)，甲藻萤光素酶，长腹水蚤荧光素酶或桡足类荧光素酶。 58.如权利要求56-57中任一项所述的方法，其中测定所述样品中的所述第二荧光素酶多肽的荧光素酶活性，并用作所收获的裂解物中存在的总单链多肽的指示物。 59.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其中所述神经元细胞从病毒表达载体表达所述单链多肽。 60.如权利要求59所述的方法，其中所述单链多肽在步骤a)之前表达6天。 61.如权利要求59所述的方法，其中所述病毒表达系统是慢病毒表达系统。 62.如权利要求54-61中任一项所述的方法，其中所述孵育步骤为约48小时。 63.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中所述收获步骤是通过添加裂解缓冲液。 64.如权利要求41-63中任一项所述的方法，其中所述BoNT切割位点来自SNAP-25、突触小泡蛋白(VAMP)或突触融合蛋白。 65.如权利要求41-64中任一项所述的方法，其中所述BoNT切割位点被BoNT A、E和C特异性识别，或者被BoNT B、D、F和G特异性识别。 66.如权利要求41-65中任一项所述的方法，其中使用具有不同BoNT切割位点的单链多肽的组合。 67.如权利要求41-66所述的方法，其中所述BoNT切割位点是人SNAP-25的a.a.141-206，或人VAMP1的a.a.35-96，人SNAP35的a.a.1-206，或VAMP1的a.a.1-96。 68.如权利要求41-67中任一项所述的方法，其中所述接头还包含BoNT受体的结合片段。 69.如权利要求68所述的方法，其中所述受体是SV2C。 70.如权利要求68-69中任一项所述的方法，其中所述结合片段包含人SV2C的氨基酸529-566。 71.如权利要求41-70中任一项所述的方法，其中所述接头包含第二荧光素酶多肽，位于所述第二荧光素酶多肽的C-末端和所述BoNT切割位点的N-末端的5至15个氨基酸的第一间隔区，位于所述BoNT切割位点的C-末端的5至15个氨基酸的第二间隔区，其中所述BoNT切割位点包含人SNAP25的氨基酸1-206，并且位于所述第一间隔区的C-末端。 72.如权利要求41-71中任一项所述的方法，其中测量荧光素酶活性是通过添加对所述荧光素酶具有特异性的底物和定量检测所得的发光信号。 73.如权利要求72所述的方法，其中SEQ ID NO：1的荧光素酶的底物是腔肠素类似物(2-呋喃基甲基-脱氧-腔肠素)。 74.一种试剂盒，其包括： a)如权利要求1-33中描述的一种或多种单链多肽，其中所述单链多肽的每一种或组合包装在单独的容器中； b)如权利要求34-37中描述的一种或多种核酸或核酸载体，其中所述核酸或核酸载体中的每一种或其组合包装在单独的容器中；和/或 c)如权利要求38-40中描述的一种或多种细胞，其中每种细胞或细胞的组合包装在单独的容器中。 75.如权利要求74所述的试剂盒，还包含包装在单独容器中的荧光素酶底物。
所属类别：	发明专利