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原文传递一种利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法

专利名称：	一种利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法
摘要：	本发明公开了一种利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，该方法首先将待检测的样品与PBS缓冲液混合后离心得到初始上清液，随后加入消化液进行水浴加热反应，再次离心后得到消化上清液并抽滤，将滤膜浸入ATP释放液中振荡提取，得到ATP提取液，接着将制备得到的发光反应液与ATP提取液在发光反应管中混合，置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，从而实现对食品中肉毒杆菌的快速检测。本发明所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法简便快速、灵敏度高，能够准确检测出食品中是否含有肉毒杆菌及相对含量，极大地促进了食品安全检测技术的提高。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	内蒙古;15
申请人：	张丽英
发明人：	张丽英;张华军
专利状态：	有效
申请日期：	2019-02-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910110444.3
公开号：	CN109932359A
分类号：	G01N21/76(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	014000 内蒙古自治区包头市昆都仑区阿尔丁大街89号稀土大厦
主权项：	1.一种利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将50 g的待检测的固态/液态样品与950 g的1×PBS缓冲液混合，经研磨/搅拌得到悬浮液/混合液，离心除去不溶物，向得到的初始上清液中加入200 μL消化液，混匀后放入40度水浴锅中进行消化反应15～20 min，然后以3000 g离心1～2 min，弃沉淀后得到消化上清液；（2）取100 mL步骤（1）得到的消化上清液进行抽滤，随后将滤膜浸入到盛放有50 mLATP释放液的烧杯中，所述ATP释放液包括Triton X-100、三甲基氨基甲烷、盐酸胍、N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸钠盐、三(2-羧乙基)膦、葡萄糖，随后加入15 μL三磷酸腺苷双磷酸酶，将烧杯转移至40℃水浴锅中速率振荡提取，得到ATP提取液；（3）在无菌环境中将荧光素酶10μL、可溶性无机镁盐30 mg、二硫苏糖醇15 mg与50 mL无菌水混合，振荡混匀，得到发光反应液；（4）吸取0.2 mL步骤（2）得到的ATP提取液于发光反应管中，加入pH 7.0～9.0的含0.13～0.15 mol/L NaCl、0.02～0.03 mol/L EDTA、0.06～0.08 mol/L环糊精的Tris-HCl缓冲液将总体积补足至0.9 mL，再加入0.1 mL步骤（3）的发光反应液，充分振荡后将混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度，检测响应时间为20～30 s。 2. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的消化液组成为：0.1～0.3 mol/L Triton X-100、0.05～0.07 mol/L乙二胺四乙酸二钠、0.02～0.04 mol/L蛋白酶K、0.5～0.9 mol/L 十二烷基硫酸钠。 3. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，所述步骤（2）中滤膜的孔径大小为0.25～0.35 μm。 4. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，所述步骤（2）中ATP释放液的组成为：0.04～0.06 mol/L Triton X-100、0.05～0.07mol/L 三甲基氨基甲烷、0.03～0.05 mol/L 盐酸胍、2～4 mmol/L N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸钠盐、13～15 mmol/L 三(2-羧乙基)膦、8～12 mmol/L 葡萄糖。 5. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，所述步骤（2）中振荡提取的速率为200 r/min，振荡提取的时间为8～10 min。 6.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，所述步骤（3）中可溶性无机镁盐为氯化镁、硝酸镁、和硫酸镁中的任意一种或几种。 7. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的振荡混匀具体是以150 r/min的速率振荡10～20 min。 8.根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，所述步骤（4）中Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。 9. 根据权利要求1所述的利用ATP生物发光反应检测食品中肉毒杆菌的方法，其特征在于，所述步骤（4）中混合液置于ATP荧光检测仪中检测发光强度的检测响应时间为25 s。
所属类别：	发明专利