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原文传递一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒及检测方法

专利名称：	一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒及检测方法
摘要：	本发明提供一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒及检测方法，该检测试剂包括试剂盒体、抗原蛋白KLH、包被抗原蛋白的酶标板、生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗、标准品KLH抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显色液B液和终止液；所述包被抗原蛋白的酶标板中，抗原蛋白KLH的包被浓度为80～85μg/mL；所述生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗的稀释倍率为1:16000～1:20000，本发明的小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，有效实现TDAR实验从定性到定量的转变，可直接进行小鼠TDAR实验的定量分析，并且具有检测灵敏度高，特异性强、操作便利和实用性好的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	海南;46
申请人：	海南医学院
发明人：	杨照新;常鹏环;黄绵庆;黄凌
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910470145.0
公开号：	CN110221058A
代理机构：	广州三环专利商标代理有限公司
代理人：	陈欢
分类号：	G01N33/535(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	570100 海南省海口市龙华区城西学院路3号
主权项：	1.一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：包括试剂盒体、抗原蛋白KLH、包被抗原蛋白的酶标板、生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗、标准品KLH抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显色液B液和终止液；所述包被抗原蛋白的酶标板中，抗原蛋白KLH的包被浓度为80～85μg/mL；所述生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗的稀释倍率为1:16000～1:20000。 2.根据权利要求1所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为每100ml含有BSA 1g，NaCl 0.8g，KCl 0.02g，KH2PO40.024g，Na2HPO4 0.144g，其余为去离子水。 3.根据权利要求1所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤缓冲液为每100ml含有吐温-20 50μL，NaCl 0.8g，KCl 0.02g，KH2PO4 0.024g，Na2HPO40.144g，其余为去离子水。 4.根据权利要求1所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液A液为每100mL含有EDTA-2Na 0.04g，柠檬酸0.19g，甘油10mL，TMB 0.04g，溶媒为去离子水；所述底物显色液B液为每100mL含有醋酸钠2.72g，柠檬酸0.32g，30％H2O260μL，溶媒为去离子水。 5.根据权利要求1所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：所述终止液为浓度2mol/L的硫酸，溶媒为纯水。 6.一种如权利要求1～5中任意一项所述的小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤： (1)取出包被抗原蛋白的酶标板，平衡至室温后去除外包装； (2)将标准品KLH抗体用样品稀释液依次稀释成1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200和1:6400八个梯度浓度； (3)将待检样品血清用样品稀释液稀释成1:400～1:800； (5)加样：加样前向包被抗原蛋白的酶标板中每孔加入200μL 5％脱脂奶粉室温再次封闭1h，倒空液体，用洗涤液清板两次，包被抗原蛋白的酶标板设有空白孔、标准品孔、待测样品孔，每个标准品孔、待测样品孔分别加入50μL稀释后的标准品KLH抗体及待检样品血清，空白孔为样品稀释液，每份样品均做复孔，37℃孵育1h或室温孵育3h； (6)洗板：重复洗板3次后，拍干； (7)每孔加入50μL稀释倍率为1:16000～1:20000山羊抗小鼠酶标二抗，室温孵育1h； (8)洗板：重复洗板3次，用洗涤缓冲液浸泡5min，再次洗板5次； (9)显色及检测：加入显色液100μL/孔，其中，底物显色液A液和底物显色液B液各50μL，室温避光孵育10～20min后，加入终止液50μL/孔，终止3～5min内，以450nm为检测波长测定OD值，参比波长为630nm。 7.根据权利要求6所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述包被抗原蛋白的酶标板的制备，包括如下步骤： (1)将抗原蛋白KLH按80～85μg/mL浓度溶解于包被液中，包被液为pH9.6碳酸盐缓冲液； (2)向96孔酶标板每孔中加入100μL步骤(1)配制的溶液，于4℃包被过夜后，倒空液体并去除残留液体，用洗涤缓冲液清板两次； (3)每孔中加入200μL 5％脱脂奶粉室温封闭1h，倒空液体4℃真空包装避光保存备用。 8.根据权利要求6所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述标准品KLH抗体的制备，包括如下步骤： (1)选用SPF级BALB/c小鼠，通过腹腔注射抗原蛋白KLH，免疫剂量为5mg/Kg，免疫体积0.5mL/只，连续免疫4-5次，免疫间隔为7天； (2)末次免疫后第7天，通过内眦静脉采血，分离血清，采用抗原亲和层析法纯化KLH多克隆抗体，并检测抗体浓度和活性。 9.根据权利要求6所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述待检样品血清的获取，包括如下步骤：选用成年SPF级BALB/c小鼠，分别设有空白对照组、阴性对照组和实验组；实验组为待测药物组，且实验组和阴性对照组分别通过腹腔注射抗原蛋白KLH，空白对照组给予等体积生理盐水，免疫剂量为5～10mg/Kg，连续免疫2次，免疫间隔为7天；首次免疫后第15天，通过内眦静脉采血，分离血清待检。
所属类别：	发明专利