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原文传递一种外周血CTC的捕获方法和检测方法

专利名称：	一种外周血CTC的捕获方法和检测方法
摘要：	本发明公开了一种外周血CTC的捕获方法和检测方法，涉及体外诊断技术领域，该方法先将红细胞去除，减少了红细胞的干扰，然后采用第一亲和物与CTC优先结合的方案使抗体更容易与CTC结合，再利用第一亲和物和第二亲和物超强的亲和能力将磁性物质吸附在CTC上，从而使CTC带有磁性，在磁场的作用下从不带磁性的细胞中分离出CTC。通过多种抗体同时孵育，可以避免CTC异质性引起的漏捕；采用磁性分离，有效减少了对CTC的机械伤害。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院
发明人：	秦樾;诸葛锐军;许坚;王志伟;卢徐锋;吴谦;杨雯;陈丽;郑娟娟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910529287.X
公开号：	CN110133294A
代理机构：	北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	覃蛟
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	325000 浙江省温州市学院西路109号
主权项：	1.一种外周血CTC的捕获方法，其特征在于，具体包括如下步骤：将从外周血分离得到的白细胞与标记有第一亲和物的特异性抗体混合，得到第一混合液；往所述第一混合液中加入标记有第二亲和物的磁性体，得到第二混合液；将所述第二混合液置于磁性分离器上分离出带有磁性体的循环肿瘤细胞；其中，所述第二亲和物可特异性结合所述第一亲和物，所述特异性抗体可特异性结合循环肿瘤细胞；优选地，所述第一亲和物为生物素，所述第二亲和物为亲和素；优选地，所述磁性体为磁珠或带磁性的微球；所述特异性抗体为EpCAM抗体，HER2抗体，VEGFA抗体和PD-L1抗体，EGFR抗体，ERBB2抗体，MS4a1抗体，CSV抗体，叶酸受体中的任意一种及其混合物，优选的，所述特异性抗体为EpCAM抗体和HER2抗体中的任意一种及其混合物。 2.根据权利要求1所述的外周血CTC的捕获方法，其特征在于，通过如下方法从外周血中分离得到白细胞：将全血与红细胞裂解液混合，第一次离心，收集白细胞沉淀，再在白细胞沉淀中加入红细胞裂解液，第二次离心，收集白细胞沉淀；在第一次离心时，全血与红细胞裂解液的体积比为1-1.2:3-3.2，在第二次离心时，白细胞沉淀与细胞裂解液的体积比为1-1.2:2-2.2。 3.根据权利要求1所述的外周血CTC的捕获方法，其特征在于，通过密度梯度离心法从外周血中分离得到白细胞，所述密度梯度离心法具体包括：将全血与生理盐水混合，置于分离介质上，离心收集白细胞；所述分离介质为聚蔗糖、葡聚糖或者硅化聚乙烯吡咯烷酮中的任意一种。 4.根据权利要求1所述的外周血CTC的捕获方法，其特征在于，将所述白细胞与标记有第一亲和物的特异性抗体混合得到第一混合液具体包括：用BSA缓冲液重悬白细胞，再与标记有第一亲和物的特异性抗体混合，低速混匀孵育，离心收集白细胞沉淀，得到第一混合液；所述低速混匀孵育的时间为10-60min。 5.根据权利要求4所述的外周血CTC的捕获方法，其特征在于，所述标记有第一亲和物的特异性抗体为生物素EpCAM抗体，生物素HER2抗体，生物素VEGF抗体，生物素PD-L1抗体，生物素EGFR抗体，生物素ERBB2抗体，生物素MS4a1抗体，生物素CSV抗体，生物素叶酸受体中的任意一种或多种抗体的混合物。 6.根据权利要求1所述的外周血CTC的捕获方法，其特征在于，将所述第一混合液中加入标记有第二亲和物的磁性体后，低速混匀孵育，得到第二混合液，再通过磁性分离分离出带有磁性体的循环肿瘤细胞，所述磁性分离的次数为1-5次。 7.一种外周血CTC的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括将权利要求1所述的捕获方法得到的带有磁性体的循环肿瘤细胞依次进行固定，染色和镜检。 8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述固定具体包括将带有磁性的循环肿瘤细胞涂布于粘附玻片上，干燥后，用固定液将带有磁性的循环肿瘤细胞固定。 9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述染色具体包括将荧光染料与标记有荧光标识物的第一抗体和第二抗体混合后，置于所述固定后的循环肿瘤细胞上，镜检观察，所述荧光染料为DAPI，所述第一抗体为CK18抗体，CK8抗体，CK19抗体和PanCK抗体中的任意一种或多种的组合，所述第二抗体优选为CD45抗体；荧光标识物为CY3，CY5，FITC，PE和APC中的任意一种；镜检第一抗体染色阳性，荧光染料染色阳性，第二抗体染色阴性，则判断该细胞为循环肿瘤细胞；若镜检第一抗体染色阴性，荧光染料染色阳性，第二抗体染色阳性，则判断该细胞为白细胞。
所属类别：	发明专利