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原文传递一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型的分析方法

专利名称：	一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型的分析方法
摘要：	本发明公开了一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，包括以下步骤：在晴朗的上午采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖为试验材料，预处理，固定与保存，采用酶解去壁低渗法，经固定、前低渗、酶解、后低渗、涂片获得较佳的染色体标本，其中酶解采用4％纤维素酶和5％果胶酶混合物酶解，吉姆萨染色，镜检；该方法简单易操作，适用于原位PCR、FISH操作的尖叶牛樟染色体核型分析方法，为牛樟细胞学研究提供技术基础。本发明首次报道了尖叶牛樟的染色体核型分析方法和核型，表明牛樟有24条染色体，核型公式为2n＝2x＝24＝22m+2sm，核型不对称系数55.81％，属于2B类型，属于较原始物种。为尖叶牛樟的起源，演化及遗传育种提供一定理论依据。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	广州甘蔗糖业研究所湛江甘蔗研究中心
发明人：	官锦燕;罗青文;谭嘉娜;罗剑飘;黄海英;文明富
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-24T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910549925.4
公开号：	CN110220904A
代理机构：	广州市南锋专利事务所有限公司
代理人：	李慧
分类号：	G01N21/84(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	524000 广东省湛江市遂溪县新桥遂湛路99号
主权项：	1.一种基于根尖的尖叶牛樟染色体核型分析方法，其特征在于：所述的分析方法具体步骤如下： S1:取材在晴朗的上午采集牛樟组培苗健壮、白嫩的根尖； S2：预处理把刚采集的根尖进行预处理； S3:固定与保存倒掉预处理液，清水冲洗后转入卡诺固定液，在黑暗4℃环境下固定24h，移弃固定液，直接用来染色体制片； S4:染色体标本制备 (1)前低渗:把S3固定的根尖置于蒸馏水中进行前低渗30min； (2)酶解:把步骤(1)的根尖置于盛有5％纤维素酶和4％果胶酶混合液的1ml离心管中，并置于37℃的恒温水浴锅中酶解3-5h； (3)后低渗:吸取酶液，缓缓地沿着管壁加入蒸馏水，后低渗30min； (4)后固定:吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液，后固定15min； (5)涂片：把玻片、临时配制的固定液均置于冰面上，取一张玻片，先滴固定液，再夹取根尖置于玻片上，用解剖针挑取白色的根尖分生组织，并迅速捣碎再均匀涂抹在载玻片上，再从一端滴加固定液使细胞扩散，接着在火焰上迅速烘烤，自然风干。 S5:染色将缓冲液甲液、乙液与吉姆萨原液按比例配制成工作液，再把干燥的制片置于吉姆萨染色液中染色10-20min，清水冲洗干净，置烘箱37℃烘干； S6:镜检用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40X物镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数，选择30个染色体分散且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞用Photoshop图像软件进行核型分析。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1所述的采集的组培生根苗根尖，挑选粗壮，白嫩且长度为0.5-1cm的根尖。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2所述的预处理为：0.002mol/L8-羟基喹啉处理2h、饱和对二甲苯处理2h或冰水混合物处理24h。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤S2所述的预处理最佳方式为：0.002mol/L8-羟基喹啉处理2h。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的染色体制片方法采用酶解去壁低渗法。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4所述的步骤(2)采用纤维素酶和果胶酶酶解的最佳时间为5h。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5所述的采用吉姆萨染色的最佳时间为15min。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3所述的卡诺固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S4的(4)所述固定液为乙醇：冰醋酸＝3∶1。 10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S5所述的甲液为KH2PO4PH＝6.8缓冲液、乙液为PH＝6.8Na2HPO4缓冲液，甲液：乙液：吉姆萨原液的比例为22:27:1。
所属类别：	发明专利