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原文传递基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法

专利名称：	基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法
摘要：	本发明涉及中药成分分析技术领域，具体为基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法。目的是为了通过建立黄芪不同极性部位组合配伍的黄芪建中汤UHPLC‑MS/MS指纹图谱，标定共有峰，通过谱效数学模型评价黄芪中化学成分治疗慢性萎缩性胃炎的作用，可以快速、准确地评价黄芪中具有治疗慢性萎缩性胃炎作用的化学成分及活性成分筛选，为黄芪的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。本发明利用化学模式识别方法将黄芪提取物在指纹图谱上所体现的化学成分的变化和药效的变化建立了相关性，为黄芪的质量控制提供了更为全面和准确的谱效基础。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山西;14
申请人：	山西大学
发明人：	刘月涛;薛倩倩;秦雪梅
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910412371.3
公开号：	CN110187020A
代理机构：	太原申立德知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	程园园
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	030006 山西省太原市坞城路92号
主权项：	1.基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，制备黄芪不同极性的部位；步骤2，将步骤1所得黄芪不同极性的部位随机组合，并与黄芪建中汤中其余六味药进行配伍；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤；步骤3，采用液相色谱串联质谱法建立黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱；步骤4，通过已有黄芪化学成分数据库及文献检索，获取黄芪建中汤总离子流图、黄芪标准品的质谱图与特征碎片，将步骤3中建立的黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱对比黄芪建中汤总离子流图，并与标准品的质谱图与特征碎片比对，找出其共有峰，得到匹配的共有峰面积数据；步骤5，对实验大鼠进行慢性萎缩性胃炎模型的复制；步骤6，以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价并进行血清的代谢组学分析，得到药效活性数据和血清代谢组学数据；步骤7，将步骤4中得到的共有峰面积数据和步骤6得到的药效活性数据带入数学模型进行灰色关联分析，评价黄芪中化学成分的药效活性；步骤8，将步骤4中得到的共有峰面积数据和步骤6得到的血清代谢组学数据带入数学模型进行灰色关联分析，评价黄芪中化学成分的药效活性；步骤9，根据步骤7和步骤8中黄芪中化学成分的药效活性得出治疗慢性萎缩性胃炎黄芪中关键的活性成分为8(3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷)、9(7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷)、15(芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-O-乙酸盐)、22(异黄芪皂苷I)，从而完成基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价。 2.根据权利要求1所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤1中制备黄芪不同极性部位的具体步骤包括：步骤1.1，取同等于黄芪建中汤复方中所含黄芪药材量的黄芪，置于圆底烧瓶中；步骤1.2，在圆底烧瓶中加入蒸馏水，回流提取，第一次加入药材的10倍量蒸馏水，回流提取2h，第二次加入8倍量的蒸馏水，提取1.5h；步骤1.3，滤过，合并滤液，滤液经回收溶剂，浓缩为浓度为0.5g/mL的黄芪水提液；步骤1.4，将步骤1.3中的黄芪水提液经AB-8大孔树脂层析柱纯化，得到黄芪不同极性的部位。 3.根据权利要求2所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤1.4中黄芪水提液经AB-8大孔树脂层析柱纯化方法，包括以下步骤：步骤1.4.1，将浓缩到0.5g/mL的黄芪水提液通过AB-8大孔吸附树脂；步骤1.4.2，用20倍柱体积的蒸馏水进行洗脱，获得A极性部位；步骤1.4.3，用10倍柱体积的35％乙醇进行洗脱，获得B极性部位；步骤1.4.4，用5倍柱体积的95％乙醇进行洗脱，获得C极性部位；步骤1.4.5，收集各洗脱部位，经回收溶剂、真空干燥，制得干燥提取物，得到黄芪不同极性的部位。 4.根据权利要求3所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤2中将步骤1所得黄芪不同极性的部位随机组合，并与黄芪建中汤中其余六味药白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖进行配伍；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤；包括：将所得A、B、C三个极性部位随机组合，得到A、B、C、AB、AC、BC、ABC七个不同极性部位的组合，并与白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣和饴糖混合；分别用10倍水与8倍水的量进行回流提取，纱布过滤，合并两次提取液并加入饴糖，减压浓缩，得到不同组分配伍的黄芪建中汤。 5.根据权利要求4所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤3中采用液相色谱串联质谱法建立黄芪不同极性部位配伍的黄芪建中汤指纹图谱的条件包括液相条件和质谱条件：其中，液相条件如下：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相为：A为含0.1％甲酸的水溶液，B为乙腈；采用梯度洗脱：0-3min，1％B；3-13min，1％B-20％B；13-15min，20％B-25％B；15-18min，25％B-30％B；18-20min，30％B-40％B；20-23min，40％B-60％B；23-25min，60％B-99％B；25-27min，99％B；27-27.5min，99％B-1％B；27.5～30min，1％B；流速：0.2mL/min；柱温：35℃，进样量：2μl；质谱条件如下：离子源：热电喷雾离子源HESI；正离子模式检测；扫描范围：m/z100-1500；扫描模式：Full Scan/dd-MS2；高离子喷射电压：+3500V；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb，毛细管温度：320℃。 6.根据权利要求5所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤4中得到的共有峰共24个，所述24个共有峰的保留时间(tR)分别为：1.74min、17.03min、18.84min、18.92min、19.88min、20.26min、20.27min、21.41min、21.82min、21.91min、22.13min、22.61min、22.85min、23.03min、23.21min、23.77min、24min、24.38min、24.82min、24.97min、25.6min、26.1min、26.25min、26.32min； 7.根据权利要求6所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤4中得到的24个共有峰分别为：1号峰为蔗糖，2号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，3号峰为芹菜素，4号峰为红车轴草苷，5号峰为甘草苷，6号峰为芒柄花苷，7号峰为毛蕊异黄酮-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐，8号峰为3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷，9号峰为7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄烷，10号峰为7,2'-二羟基-3,4'-二甲氧基异黄酮，11号峰为毛蕊异黄酮，12号峰为二羟基-二甲氧基异黄酮，13号峰为黄芪皂苷VII，14号峰为黄芪异黄酮葡萄糖苷，15号峰为芒柄花素-7-o-葡萄糖-6”-o-乙酸盐，16号峰为二羟基-三甲氧基-二甲氧基异黄酮，17号峰为黄芪皂苷IV，18号峰为黄芪皂苷III，19号峰为芒柄花素，20号峰为7-羟基-6,4'-二甲氧基异黄烷，21号峰为黄芪皂苷II，22号峰为异黄芪皂苷I，23号峰为华良姜素，24号峰为黄芪皂苷I。 8.根据权利要求7所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤5中对实验大鼠进行慢性萎缩性胃炎模型的复制的步骤包括：步骤5.1，大鼠适应一周后随机分为空白对照组和模型组；步骤5.2，空白对照组大鼠自由饮水与摄食；模型组大鼠给予0.1％氨水与20mmol/L脱氧胆酸钠，每日交替饮用，同时采用饥饿紊乱法造模，两天足食，一天禁食，循环实施10周，建立慢性萎缩性胃炎模型，实现慢性萎缩性胃炎大鼠模型的复制。 9.根据权利要求8所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤6以黄芪为君药的黄芪建中汤为对象，以慢性萎缩性胃炎造模的大鼠为药效评价平台进行药效评价并进行血清的代谢组学分析得到药效活性数据和血清代谢组学数据，包括: 步骤6.1，慢性萎缩性胃炎大鼠模型复制4周后，从第5周灌胃给予黄芪建中汤，给药量为10.605g生药/kg，给药周期为6周,实验期间，每三天对大鼠进行称重，记录体重，绘制体重趋势图；步骤6.2，慢性萎缩性胃炎大鼠最后一次称重后，禁食不禁水48h进行腹主动脉取血，使用乙醚麻醉慢性萎缩性胃炎大鼠，结扎胃部贲门，大鼠储存胃液3h，缝合腹腔，皮下注射10％的水合氯醛麻醉大鼠，先结扎贲门，后腹主动脉取血，收集血液，摘出全胃，洗去表面血水，滤纸吸干，收集胃液，将所得胃液与血液均在4℃、3000rpm/min下离心15min，分别获得上清，其中部分胃液上清立即检测，获得胃液pH值，并依据南京建成试剂盒说明操作测定胃蛋白酶(PA)的活性，其余胃液与血液上清保存在-80℃待测，并通过冷冻离心机离心得到血清样本，从而得到药效活性数据；步骤6.3，取解冻后300μL血清样本与300μL D2O混合，涡旋60s，于4℃、13,000rpm下离心10min，取550μL上清转移到直径为5mm的核磁管中进行核磁检测；步骤6.4，利用SPSS16.0对各组大鼠的血清差异代谢物数据进行主成分分析；根据相关矩阵、特征值与累计方差贡献率获得相应的主成分,选择方差排名靠前的主成分，保留了初始变量的大部分信息，可将其作为血清代谢组学的评价指标，从而得到血清代谢组学数据。 10.根据权利要求1-9任一项所述的基于治疗慢性萎缩性胃炎谱效关系的黄芪成分评价方法，其特征在于：所述步骤7和步骤8中的灰色关联分析包括如下步骤：步骤S1，将传统药效指标与血清核磁代谢组学数据作为参考数列Y，指纹图谱中化学成分的面积作为比较数列Xi：参考数列Y(k)，k＝1,2,3...m 比较数列Xi(k)，i＝1,2,3...m 步骤S2，对数据进行最大值标准化；步骤S3，根据步骤S2所得标准化数据计算各共有峰与药效之间的关联系数，其中关联系数按以下公式计算： i＝1,2,3,...,n；k＝1,2,3,...,m；其中，ξi为第k个样品的比较数列Xi与参考数列Y的关联系数， Δi(k)＝\|Y(k)-Xi(k)\|比较数列与参考数列差值的绝对值； Δmin＝minminΔi(k),两极的最小差值；Δmax＝maxmaxΔi(k),两极的最大差值；步骤S4，对步骤S3所得关联系数按以下公式进行关联度的计算：步骤S5，对步骤S4所得关联度进行排序，以评价各共有峰的药效活性，从而得到黄芪中化学成分的药效活性。
所属类别：	发明专利