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原文传递一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法

专利名称：	一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法
摘要：	本发明提供了一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法。先用高效液相色谱将叶酸和5‑甲基四氢叶酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，标准品与内标物的峰面积为比值为Y轴，建立校准曲线，计算上述叶酸和5‑甲基四氢叶酸的含量。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理方法简便，耗时短，大大节约了时间成本。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海可力梅塔生物医药科技有限公司
发明人：	黄泽博;朱监宝;官培龙;于嘉屏
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-20T00:00:00+0800
申请号：	CN201910526597.6
公开号：	CN110146626A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	肖明芳
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200433 上海市杨浦区翔殷路128号11号楼D座3楼312室
主权项：	1.一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的叶酸分别为叶酸和5-甲基四氢叶酸；采用高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法包括如下步骤：先用高效液相色谱将叶酸和5-甲基四氢叶酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，标准品与内标物的峰面积为比值为Y轴，建立校准曲线，计算上述叶酸和5-甲基四氢叶酸的含量，具体的色谱条件为： (1)色谱条件色谱柱为Phenomenex2.6μm F5 100A°；流动相A为0.1vt％甲酸的水溶液；流动相B为0.1vt％甲酸的乙腈溶液；柱温为40℃；进样量为5μL；采用梯度模式洗脱，见表1；表1 流动相梯度洗脱参数时间/min 流速/μL/min A/％ B/％ 0.01 500 90 10 4.00 500 50 50 4.05 500 10 90 4.85 500 10 90 4.90 500 90 10 7.00 500 90 10 (2)质谱条件在电喷雾离子正离子检测模式下，采用MRM扫描分析，离子源参数：雾化气流量为3L/min；干燥气流量为2L/min；加热气流量为15L/min；DL管温度为100-400℃；接口温度为100-400℃；加热块温度为100-400℃，CID气：100-300kPa；前体与产物离子通道如表2所示；表2 多反应监测离子对及相应的电压参数 2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的血斑按照如下方法制备得到：(1)用打孔器取直径2～8mm样本于2mL EP管中，加入100～500μL工作液，500～2000rpm涡旋混匀10～60min；(2)取上清液50～450μL于96孔深孔板中，室温10～100L/min氮气吹干；(3)加入50～400μL复溶液，500～2000rpm振摇5～60min。 3.根据权利要求2所述的一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的工作液按照如下方法制备得到：按1：10：10：1000的体积比将提取液添加剂：联合抗氧化剂：混合内标液：提取液充分混匀。 4.根据权利要求3所述的一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的提取液添加剂为氨水，提取液为70vt％甲醇水溶液。 5.根据权利要求3所述的一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的联合抗氧化剂为二硫苏糖醇、抗坏血酸和柠檬酸的混合物，其中，二硫苏糖醇、抗坏血酸和柠檬酸的质量比为1：1：1。 6.根据权利要求3所述的一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的混合内标为含有10μg/mL的叶酸-13C5和10μg/mL的5-甲基四氢叶酸-d3的水溶液。 7.根据权利要求2所述的一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的复溶液为1％vt联合抗氧化剂水溶液。 8.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的标准品为含有叶酸和5-甲基四氢叶酸的血斑，具体浓度见表3，表3 标准品对应的浓度(ng/mL) 叶酸 C1 C2 C3 叶酸 50 5 0.5 5-甲基四氢叶酸 50 5 0.5 。 9.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱联用技术测定血斑中叶酸的方法，其特征在于，所述的标准品按照如下步骤制备得到： (1)使用生理盐水清洗兔红细胞，备用； (2)配置50mg/mL含100μg/mL联合抗氧化剂的人血清白蛋白溶液：称量2g人血清白蛋白粉末，加入100μg/mL联合抗氧化剂的生理盐水40mL，混匀后配制成浓度为50mg/mL人血清白蛋白溶液； (3)按照55：45的体积比充分混合兔红细胞与人血清白蛋白溶液制成基质； (4)制备100μg/mL联合抗氧化剂水溶液；储备液的配置：分别称取50mg的叶酸和50mg的5-甲基四氢叶酸，分别加入100μg/mL联合抗氧化剂水溶液1L，配置成浓度为50μg/mL的叶酸储备液和50μg/mL5-甲基四氢叶酸储备液；浓度为C1标准品的制备：分别取叶酸储备液和5-甲基四氢叶酸储备液各10μL，用基质稀释定容至1000μL，即得浓度为500ng/mL的标准品；取浓度为500ng/mL叶酸和500ng/mL5-甲基四氢叶酸各300μL，用基质稀释定容至3000μL，即得浓度为C1的标准品；浓度为C2标准品的制备：取浓度为C1的叶酸和5-甲基四氢叶酸各300μL，用基质稀释定容至3000μL，即得浓度为C2的标准品；浓度为C3标准品的制备：取浓度为C2的叶酸和5-甲基四氢叶酸各300μL，用基质稀释定容至3000μL，即得浓度为C3的标准品； (5)取各浓度的标准品66μL滴于特质滤纸片上，晾干收集-20℃避光保存。
所属类别：	发明专利