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原文传递一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒

专利名称：	一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒
摘要：	本发明公开了一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒，包括标准品、质控品、混合内标液、洗脱液A、洗脱液B、提取液、提取液添加剂、联合抗氧化剂和复溶液，所述的叶酸分别为叶酸和5‑甲基四氢叶酸。采用本发明试剂盒进行检测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理方法简便，耗时短，大大节约了时间成本，精密度与回收率基本满足要求。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海可力梅塔生物医药科技有限公司
发明人：	朱监宝;黄泽博;官培龙;于嘉屏
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-20T00:00:00+0800
申请号：	CN201910526620.1
公开号：	CN110146628A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	肖明芳
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200433 上海市杨浦区翔殷路128号11号楼D座3楼312室
主权项：	1.一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒，其特征在于，所述的叶酸分别为叶酸和5-甲基四氢叶酸；所述的试剂盒包括如下试剂： (1)标准品：含有叶酸和5-甲基四氢叶酸的血斑； (2)质控品：含有叶酸和5-甲基四氢叶酸的血斑； (3)混合内标液：叶酸-13C5和5-甲基四氢叶酸-d3的水溶液； (4)洗脱液 A：0.1％vt洗脱液添加剂的水溶液； B：0.1％vt洗脱液添加剂的乙腈溶液； (5)提取液：70％vt甲醇的水溶液； (6)提取液添加剂：氨水； (7)联合抗氧化剂：二硫苏糖醇、抗坏血酸和柠檬酸的混合物； (8)复溶液：含有联合抗氧化剂的水溶液。 2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括：96孔板、操作说明书和分隔并集中包装这些试剂盒或管的包装盒中的任意一种或几种组合。 3.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒，其特征在于，标准品为含有叶酸和5-甲基四氢叶酸的血斑，具体浓度见表1，表1 标准品对应的浓度(ng/mL) 叶酸 C1 C2 C3 叶酸 50 5 0.5 5-甲基四氢叶酸 50 5 0.5 。 4.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒，其特征在于，质控品为含有叶酸和5-甲基四氢叶酸的血斑，分高、低两个浓度，分别是QCH、QCL；其中QCH、QCL中叶酸质控品对应的浓度见表2，表2 质控品对应的浓度(ng/mL) 叶酸 QCH QCL 叶酸 30 6 5-甲基四氢叶酸 30 6 。 5.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒，其特征在于，所述的混合内标为含有10μg/mL的叶酸-13C5和10μg/mL的5-甲基四氢叶酸-d3的水溶液。 6.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液添加剂为甲酸；所述的联合抗氧化剂为二硫苏糖醇、抗坏血酸和柠檬酸以质量比为1：1：1混合的混合物。 7.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的试剂盒，其特征在于，所述的复溶液为1％vt联合抗氧化剂水溶液。 8.权利要求1～7任意一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于， (1)标准品： a.使用生理盐水清洗兔红细胞，备用； b.配置50mg/mL含100μg/mL联合抗氧化剂的人血清白蛋白溶液：称量2g人血清白蛋白粉末，加入100μg/mL联合抗氧化剂的生理盐水40mL，混匀后配制成浓度为50mg/mL人血清白蛋白溶液； c.按照55：45的体积比充分混合兔红细胞与人血清白蛋白溶液制成基质； d.制备100μg/mL联合抗氧化剂水溶液；储备液的配置：分别称取50mg的叶酸和50mg的5-甲基四氢叶酸，分别加入100μg/mL联合抗氧化剂水溶液1L，配置成浓度为50μg/mL的叶酸储备液和50μg/mL5-甲基四氢叶酸储备液；浓度为C1标准品的制备：分别取叶酸储备液和5-甲基四氢叶酸储备液各10μL，用基质稀释定容至1000μL，即得浓度为500ng/mL的标准品；取浓度为500ng/mL叶酸和500ng/mL5-甲基四氢叶酸各300μL，用基质稀释定容至3000μL，即得浓度为C1的标准品；浓度为C2标准品的制备：取浓度为C1的叶酸和5-甲基四氢叶酸各300μL，用基质稀释定容至3000μL，即得浓度为C2的标准品；浓度为C3标准品的制备：取浓度为C2的叶酸和5-甲基四氢叶酸各300μL，用基质稀释定容至3000μL，即得浓度为C3的标准品； e.取各浓度的标准品66μL滴于特质滤纸片上，晾干收集-20℃避光保存； (2)质控品：分别取浓度为C1的叶酸储标准品和5-甲基四氢叶酸标准品各3mL，分别用基质定容至5mL和25mL得到30ng/mL和6ng/mL的叶酸和5-甲基四氢叶酸；取各浓度的质控品66μL滴于特质滤纸片上，晾干收集-20℃避光保存； (3)混合内标液：制备含10μg/mL的叶酸-13C5和5-甲基四氢叶酸-d3的水溶液。 (4)洗脱液：70％vt甲酸的水溶液； A：制备含0.1％vt甲酸的水溶液； B：制备含0.1％vt甲酸的乙腈溶液； (5)提取液：制备70％vt甲醇的水溶液； (6)提取液添加剂：氨水； (7)联合抗氧化剂：制备质量比为1：1：1的二硫苏糖醇、抗坏血酸和柠檬酸的混合物； (8)复溶液：制备1％vt联合抗氧化剂水溶液。 9.权利要求1～7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的使用包括如下步骤： (1)准备工作液：按1：10：10：1000的体积比将提取液添加剂：联合抗氧化剂：混合内标液：提取液充分混匀； (2)样品前处理：用打孔器分别取直径2～8mm样本于2mL EP管中，加入100～500μL工作液，500～2000rpm涡旋混匀10～60min；取上清液50～450μL于96孔深孔板中，室温10～100L/min氮气吹干；加入50～400μL复溶液，500～2000rpm振摇5～60min； (3)移液：将步骤(2)每个孔板中溶液转移到96微孔板进样板孔内； (4)液相串质谱条件设定：根据实际仪器型号分别设置高效液相色谱-串联质谱仪的工作参数和条件； (5)样品检测：取处理好的标准品、质控品和检测样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，并记录色谱图与检测样本叶酸与5-甲基四氢叶酸的峰面积和其内标峰面积； (6)结果分析：绘制标准曲线和拟合标准曲线回归方程，计算样品中叶酸和5-甲基四氢叶酸的浓度。 10.权利要求1～7任意一项所述的试剂盒在利用超高液相色谱串质谱技术检测血斑中叶酸的应用。
所属类别：	发明专利