详情

原文传递高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法

专利名称：	高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法
摘要：	本发明提供一种高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸(α‑十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3‑二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸)的方法。先用高效液相色谱将4种游离脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品与内标物的峰面积比值为Y轴，建立校准曲线，计算人干血斑中上述4种游离酸的含量。本发明方法灵敏度较高、特异性强、准确且前处理过程简单，用时较短，提高了检测效率。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海可力梅塔生物医药科技有限公司
发明人：	邱碧涵;官培龙;朱监宝;于嘉屏
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-20T00:00:00+0800
申请号：	CN201910527204.3
公开号：	CN110146629A
代理机构：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
代理人：	肖明芳
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	200433 上海市杨浦区翔殷路128号11号楼D座3楼312室
主权项：	1.高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，所述的4种游离脂肪酸为：α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸；采用高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法包括如下步骤：先用高效液相色谱将4种游离脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品与内标物的峰面积比值为Y轴，建立校准曲线，计算上述4种游离酸的含量，具体的色谱条件为： (1)高效液相色谱色谱条件：色谱柱型号：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 3*100mm；流动相A：0.1vt％饱和一元羧酸的水溶液；流动相B：0.1vt％饱和一元羧酸和0.1vt％C1-C3胺化合物的甲醇溶液；柱温：40℃；流速：0.4mL/min；进样量：2μL；运行时间：12min；采用梯度模式洗脱的方式，见表1；表1流动相梯度洗脱参数时间/min 流速/mL/min A/％ B/％ 0 0.4 30 70 8 0.4 0 100 10 0.4 0 100 12 0.4 30 70 (2)质谱条件：在电喷雾离子正离子检测模式下，采用多反应监测的扫描模式；接口电压为4kV；DL温度：250℃；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；干燥气：10L/min；雾化气：3L/min；各目标物相应的保留时间、多反应监测离子对及电压参数见表2；表2多反应监测离子对及相应的电压参数 2.根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，所述的人干血斑按照如下方法制备得到：(1)提取：取直径6mm干血斑样本于2mL离心管中，向其中加入200μL含内标的提取液，然后以2500rpm涡旋震荡30min，将上述混合溶液取150μL溶液用氮气仪吹干；(2)衍生：再加入200μL衍生试剂1，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生30min，吹干；再加入200μL衍生试剂2，室温下，以500rpm涡旋震荡衍生5min，吹干；(3)复溶：加400μL复溶液，室温下，以2500rpm涡旋震荡混匀5min。 3.根据权利要求2所述的高效液相色谱串质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的含内标的提取液按照如下方法制备得到：分别取20μM氘代同位素内标物450μL，包括十碳三烯八酸-13C18，二十碳五烯酸-d5，二十二碳六烯酸-d5，加入45mL甲醇配置得到浓度均为200nM的含内标的提取液。 4.根据权利要求2所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的衍生试剂1为10vt％乙酰氯的二氯甲烷溶液；衍生试剂2为1vt％三吡啶甲基胺的乙腈溶液。 5.根据权利要求2所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的复溶液为饱和一元醇。 6.根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，所述的标准品为含有α-十八碳三烯酸，二十碳五烯酸，ω3-二十二碳五烯酸，二十二碳六烯酸的甲醇、人造兔血溶液，具体浓度见表3，表3 4种游离脂肪酸标准品对应的浓度(μM) 脂肪酸 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 α-十八碳三烯酸 200 100 40 20 10 4 2 二十碳五烯酸 20 10 4 2 1 0.4 0.2 ω3-二十二碳五烯酸 50 25 10 5 2.5 1 0.5 二十二碳六烯酸 200 100 40 20 10 4 2 。 7.根据权利要求1所述的高效液相色谱质谱联用技术测定人干血斑中4种游离脂肪酸的方法，其特征在于，所述的标准品按照如下步骤制备得到：浓度为J1标准品的制备：分别取50mMα-十八碳三烯酸160μL、100mM二十碳五烯酸8μL、100mMω3-二十二碳五烯酸20μL、50mM二十二碳六烯酸160μL，分别加入1652μL的甲醇，制备4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸；再取4μM的α-十八碳三烯酸、0.4μM的二十碳五烯酸、1μM的ω3-二十二碳五烯酸和4μM的二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至3000μL，即得浓度为J1标准品；浓度为J2标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各500μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J2标准品；浓度为J3标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各200μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J3标准品；浓度为J4标准品的制备：取浓度为J1的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各150μL，用人造兔血定容至1500μL，即得浓度为J4标准品；浓度为J5标准品的制备：取浓度为J2的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J5标准品；浓度为J6标准品的制备：取浓度为J3的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J6标准品；浓度为J7标准品的制备：取浓度为J4的α-十八碳三烯酸、二十碳五烯酸、ω3-二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸各100μL，用人造兔血定容至1000μL，即得浓度为J7标准品。
所属类别：	发明专利