详情

原文传递一种检测多亚型HPV E7蛋白的方法及其应用

专利名称：	一种检测多亚型HPV E7蛋白的方法及其应用
摘要：	本发明公开了一种检测多亚型HPV E7蛋白的方法及其应用，涉及蛋白检测领域。该检测方法将2种兔源单克隆抗体混合作为第一抗体，筛选能够与兔源单抗成功配对并识别多种亚型HPV E7蛋白的鼠源单克隆抗体作为第二抗体，可识别HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV56、HPV58、HPV68中的一种或多种亚型。本发明制备得到的鼠源单克隆抗体效价高，特异性好，利用本发明提供的检测方法、检测卡和免疫检测试剂盒检测样品中HPV E7蛋白含量，灵敏度显著提高、操作简单、方便。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	艾托金生物医药(苏州)有限公司
发明人：	常小迦;施丽君;郑雅婷;时成龙
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910430877.7
公开号：	CN110196332A
代理机构：	北京精金石知识产权代理有限公司
代理人：	张黎
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	215001 江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米科技园B3-401室
主权项：	1.一种采用抗体检测HPV E7蛋白抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)将固定化的第一抗体与样品中的HPV E7蛋白接触，形成第一复合物； (2)将(1)中的第一复合物与第二抗体接触形成第二复合物； (3)检测(2)中的第二复合物；所述第一抗体为针对HPV E7蛋白的兔源单克隆抗体；所述第二抗体为带有检测标记的针对HPV E7蛋白的鼠源单克隆抗体；所述检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物标记、放射性核素标记、荧光素标记或纳米粒子标记。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的HPV是HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV56、HPV58、HPV68中的一种或多种亚型。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一抗体为包含2种针对HPV E7蛋白不同抗原表位的兔源单克隆抗体；所述的兔源单克隆抗体包括克隆号为RAB-139和RAB-034的兔源单克隆抗体。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鼠源单克隆抗体能够与兔源单克隆抗体成功配对并识别多种亚型HPV E7蛋白的鼠源单克隆抗体。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鼠源单克隆抗体的制备方法包括以下步骤： (A1)动物免疫：免疫原为GST-HPV18E7重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，皮下或腹腔注射方式免疫小鼠，免疫剂量为50μg/只，免疫三次后测定血清效价，选取抗体效价最高的小鼠作为免疫小鼠； (A2)细胞融合与培养：收集(A1)获得的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合比率为脾细胞：骨髓瘤细胞＝5:1，HAT培养基选择性培养，采用His-HPV18E7包被的酶标板进行ELISA检测，得到阳性融合细胞； (A3)筛选和克隆：取(A2)获得的阳性融合细胞利用有限稀释法进行亚克隆，得到稳定的阳性细胞株，以His-HPV18E7、His-HPV16E7、His-HPV45E7、His-HPV39/59E7混合蛋白和His-HPV6/11E7混合蛋白为抗原，筛选阳性细胞株，获得结合HPV E7蛋白的杂交瘤细胞； (A4)单克隆抗体的制备：用液体石蜡致敏小鼠，腹腔注射(A3)得到的杂交瘤细胞的悬液，细胞用量为1x106/只，一周后抽取小鼠腹水，腹水经去除纤维蛋白处理、纯化、透析，检测抗体蛋白浓度、纯度、抗体效价，得到鼠源单克隆抗体；所述的GST-HPV18E7重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的His-HPV16E7的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的His-HPV18E7的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述的His-HPV39E7的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述的His-HPV45E7的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述的His-HPV59E7的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述的His-HPV6E7的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；所述的His-HPV11E7的重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品为人或动物组织样品、肿瘤切除样品、宫颈脱落细胞、液基细胞样本。 7.一种用于检测HPV E7蛋白的检测板，其特征在于，所述检测板为酶标板或侧流式检测板。 8.根据权利要求7所述的检测板，其特征在于，所述的酶标板中包被有权利要求1所述的第一抗体；所述的侧流式检测板包括基片和测试条，测试条粘贴在基片上，测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成；所述的滤样纸为抗原加样区，所述的层析材料为权利要求1所述的第二抗体结合区，所述的硝酸纤维素膜上可固定权利要求1所述的第一抗体。 9.一种用于检测HPV E7蛋白的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求7所述的检测板、权利要求1所述的第一抗体、权利要求1所述的第二抗体。 10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括缓冲液和细胞裂解试剂。
所属类别：	发明专利