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原文传递一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法

专利名称：	一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法
摘要：	本发明采用G‑四联体‑Hemin过氧化物模拟酶和谷氨酰胺合成酶双酶偶联体系，利用谷氨酸合成酶的选择性，特异性的识别谷氨酰胺，将谷氨酰胺定量转化为荧光信号，通过标准曲线的方法测定样品中谷氨酰胺的含量，本测定方法操作方便、成本低、快速准确、灵敏度高且对样本的损伤较小，可以广泛的应用于生物、农业等领域。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	苏州健雄职业技术学院
发明人：	朱志强;金晨
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201910560689.6
公开号：	CN110186892A
代理机构：	苏州市方略专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	刘燕娇
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	215411 江苏省苏州市太仓市科教新城健雄路1号
主权项：	1.一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）将富含有鸟嘌呤的单链DNA和富含有腺嘌呤的单链DNA分别溶解于TE缓冲液中，4℃保存，得DNA溶液A和DNA溶液B；（2）血红素经二甲亚砜溶解后，4℃存放于磷酸钾缓冲溶液，得血红素溶液；（3）将DNA溶液A与DNA溶液B以及血红素溶液混合，室温静置30-60分钟后得DNA模拟酶溶液，4℃保存；（4）配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，谷氨酰胺标准溶液和荧光试剂溶液；（5）待测样品取样后加入酶标板加样孔中，谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；（6）向上述酶标板的加样孔加入谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵育0.5-1.5小时；（7）向上述酶标板的加样孔加入DNA模拟酶溶液和荧光试剂溶液，孵育1-2小时；（8）用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据谷氨酰胺标准溶液的浓度和信号绘制标准曲线，根据标准曲线算出样品浓度。 2.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述富含有鸟嘌呤的单链DNA的序列为SEQ ID NO.1；步骤（1）中所述富含有腺嘌呤的单链DNA的序列为SEQ ID NO.2。 3.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述血红素为氯化血红素。 4.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于所述步骤（3）中，所述富含有鸟嘌呤的单链DNA：富含有腺嘌呤的单链DNA：血红素的摩尔比为1:1:2。 5.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于所述谷氨酰胺合成酶工作溶液中包含以下组分：L-谷氨酰胺、α-酮戊二酸、Mg2+以及谷氨酰胺合成酶。 6.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于所述谷氨酰胺标准溶液的浓度分别为0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M。 7.根据权利要求1所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，所述荧光试剂溶液为Amplex Red。 8.根据权利要求1-7任一项所述一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于包含以下具体步骤：（1）配制溶解所需DNA的TE缓冲液（10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mM乙二胺四乙酸钠，pH7.4），分别将序列为5’-TTTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3’、 5’- CGAACTCTGCAACATAAAAAA -3’的两段DNA的DNA溶解于上述TE缓冲液中，得浓度为10μM 的DNA溶液A和DNA溶液B，4℃保存；（2）配制磷酸钾缓冲溶液（200mM K2HPO4-KH2PO4，400 mM NaCl，pH 7．4），使用少量二甲亚砜溶解氯化血红素，随后用该磷酸钾缓冲制备，得到浓度为10μM的血红素溶液，4℃保存；（3）将上述DNA溶液A与DNA溶液B和血红素溶液按1：1：2的体积比混合，室温静置30-60分钟得到DNA模拟酶溶液，4℃保存；（4）配制谷氨酰胺合成酶工作溶液，该反应液为pH 7.4 ，200 mM 磷酸缓冲溶液，含有20mM L-谷氨酰胺、20mMα-酮戊二酸、2mM Mg2+以及2mM谷氨酰胺合成酶；配制0M、2×10-6M、4×10-6M、6×10-6M、8×10-6M、1×10-5M谷氨酰胺的标准溶液；配制荧光试剂溶液，该溶液为pH7．4 ，200 mM磷酸缓冲溶液，另含400 mM NaCl与500μM荧光试剂（Amplex Red）；（5）取待测样品10μL，加入酶标板的小孔中；谷氨酰胺标准溶液加入同一酶标板的其他加样孔中；（6）向上述酶标板的加样孔加入20μL谷氨酰胺合成酶工作溶液，孵育1小时；（7）向上述酶标板的加样孔加入10μL的DNA模拟酶溶液和10μL荧光试剂溶液，孵育1.5小时；（8）用酶标仪在530nm激发，在590nm检测荧光信号，根据谷氨酰胺标准溶液的浓度和信号绘制标准曲线，根据标准曲线算出样品浓度。 9.根据权利要求8所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法，其特征在于，步骤（5）中的取样包含以下详细步骤：采用五点取样法选取五株小麦，每株选取三个叶片，用孔径为6mm的打孔器于小麦叶片上打孔取样，于靠近叶柄、叶片中部及叶尖处取样；随后将样品放入液氮冷冻，取出后置于0.2mL离心管，加入少量石英砂，仔细研磨10分钟后放入高速冷冻离心机，4℃条件下13200rpm离心30分钟，用微量移液器从0.2mL离心管中吸取上清液（10µL左右），加入酶标板的小孔中。 10.根据权利要求1-7任一项所述的一种基于双酶偶联的谷氨酰胺检测方法在植物叶片的谷氨酰胺含量测定中的应用。
所属类别：	发明专利