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原文传递一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法及应用

专利名称：	一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法及应用
摘要：	本发明涉及一种基于共振能量转移的抗体定向固定双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，属于电化学发光检测技术领域。三氧化钼对三联吡啶钌具有良好的猝灭效果，金纳米粒子与三氧化钼成功的复合，进一步增强了三氧化钼对三联吡啶钌的电致化学发光信号的猝灭作用。采用HWRGWVC多肽链作为特异性捕获体，实现抗体的定向位点捕获。根据对不同浓度的原降钙素响应的电化学发光信号强度不同，实现对原降钙素的检测。通过采用加标回收法来检测不同浓度的原降钙素在人类血清中的样品回收率，以展示本方法的准确度和精密度，测得回收率的范围为100.3~104.2%，说明该方法准确可靠。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	魏琴;薛经纬;王欢;吴丹;马洪敏;冯锐;范大伟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-10T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910495084.3
公开号：	CN110220889A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	李茜
分类号：	G01N21/76(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号
主权项：	1.一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；（2）在处理好的电极表面滴加6 μL、浓度为0.5~5 mg/mL的三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟分散液作为传感基底材料，4 °C下晾干成膜；（3）加入3~8 mM巯基乙酸在4 °C下浸泡5 h后转入EDC/NHS混合体系中浸泡30 min来活化羧基；（4）继续在4 °C条件下浸泡浓度为5~15 μg/mL的原降钙素一抗1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗净电极表面，4°C下晾干；（5）在质量浓度为1~3%的牛血清白蛋白中浸泡来封闭非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，常温下晾干；（6）滴加6 μL、浓度为0.0001~50 ng/mL的原降钙素抗原，在室温下孵化1 h后，用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，室温下晾干；（7）继续滴加6 μL、浓度为2~4 mg/mL的金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液于电极表面，室温下孵化1 h，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液缓慢冲洗电极表面，室温下晾干。 2.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述基底材料三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备，包括以下步骤：（1）中空多片层硫化铟的制备首先制备前驱体：4~6 mg水合硝酸铟和5~8 mg 1,4-对苯二甲酸酸溶解在2 mL的N, N-二甲基甲酰胺，搅拌10 min; 然后，将混合均匀的溶液在120°C下加热30 min，冷却到室温后，所得白色沉淀用乙醇洗三次并干燥; 其次，前驱体添加到含有200~500 mg的硫脲的40 mL乙醇溶液中搅拌2 min，混合物转移到一个80 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中在180°C反应3 h 冷却到室温后，用乙醇和超纯水对沉淀进行三次清洗并干燥，得到黄色的粉末即为中空多片层硫化铟；（2）三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟的制备称取2~5 mg中空多片层硫化铟溶于1 mL去离子水配制成2 mg/mL溶液，向其中加入1mL、1×10-3 mol/L的三联吡啶钌混合，在室温下避光振荡12 h，经过离心后重新分散到1 mL去离子水中得到三联吡啶钌负载的中空多片层硫化铟，储存在4°C下备用。 3.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，其特征在于，所述金复合的三氧化钼空心纳米球标记的原降钙素检测抗体溶液的制备，包括以下步骤：（1）三氧化钼空心纳米球的制备首先，将0.12~0.18 g C10H14MoO6在20~50 mL正丁醇中超声溶解10 min，使固体均匀分散到溶剂中; 然后在磁力搅拌下，将5~10 mL1 M硝酸添加到混合溶液后持续搅拌1 h; 将获得混合溶液转移到一个50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜; 之后，在220°C下加热12 h，并冷却到室温; 用去离子水和无水乙醇依次洗涤黑色沉淀物2~6次; 在60°C干燥5 h后得到前驱体MoO2，然后在300~550°C空气氛围下加热2~5 h; 获得的白色MoO3粉末; （2）金复合的三氧化钼空心纳米球的制备 1~3 mL HAuCl4（1%）和10~15 mg 聚乙烯吡咯烷酮添加到上述混合溶液中搅拌10 h; 随后，4 mL的柠檬酸钠溶液（50mM）和0.05~0.1 mgNaBH4被添加到混合搅拌12 h，用超纯水和无水乙醇清洗后所得固体即为金复合的三氧化钼空心纳米球；（3）金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液的制备将1mL 50 ng/mL HWRGWVC多肽链溶液加入上述溶液中，在4°C振荡1h； 12000 rpm离心后，将沉淀物分散到1 mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中; 随后400 μL 0.1% BSA的加入溶液中用来封闭特异性活性位点; 离心分离和洗涤后；随后加入100~300 μL 10 mg/mL的原降钙素抗原的二抗，在4°C下孵化10~15 h；随后离心去除上清液，重新分散到在1~3 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到金复合的三氧化钼空心纳米球二抗孵化液，储存在4 °C下备用。 4.如权利要求1所述的一种双猝灭电化学发光策略应用于原降钙素的检测的传感器制备方法，用于样品的检测，其特征在于，步骤如下：（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600 V，循环伏安扫描电位范围为0~1.15 V，扫描速率为0.12 V/s；（2）将处理完毕的电致化学发光传感器浸入在10 mL、pH 6.5~8.6的含浓度为5~15mmol/L过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液中，接通电化学发光系统，孵化不同浓度的原降钙素时传感器进行测试，根据产生的不同的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；（3）将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
所属类别：	发明专利