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原文传递一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法

专利名称：	一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法
摘要：	本发明涉及一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法。本发明采用构建拼合式光电化学传感器的方式，将免疫识别分析与无机半导体材料光电响应测试分析分开，实现光电测试不破坏生物分子的免疫识别过程的目的。以硫化镉纳米材料修饰的锡酸铋纳米材料作为基底材料提供基础的光电响应，二者带隙结构匹配，能够很好的提高可见光利用效率。其次在96微孔板中进行抗原与抗体的特异性免疫识别过程，乙酰胆碱酯酶通过胺化合醛基化的二氧化硅材料与降钙素原二抗牢固结合，以此复合物作为标记物标记的降钙素原二抗，当96微孔板中滴入碘化乙酰硫代胆碱后，乙酰胆碱酯酶与之发生催化反应，得到的产物硫代胆碱作为电子供体，捕获材料受光激发产生的空穴，在不同程度上提高光电流，实现对降钙素原的灵敏检测。其检测限为0.20 pg/mL。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	魏琴;冷东全;范大伟;吴丹;曹伟;马洪敏;张勇
专利状态：	有效
申请日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-26T00:00:00+0800
申请号：	CN201910853996.3
公开号：	CN110501393A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	赵凤
分类号：	G01N27/26(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号
主权项：	1.基于一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）锡酸铋材料的制备取0.8 ~ 1.0 g五水合四氯化锡溶解于10 ~ 30 mL超纯水中，用3 ~ 5 M.的氢氧化钠水溶液将上述溶液调pH至4 ~ 6，搅拌10 ~ 20分钟，后离心得到白色沉淀；将得到的沉淀溶于30 ~ 50 mL含有1.8 ~ 2.0 g五水合硝酸铋的超纯水中，用3 ~ 5 M.的氢氧化钠水溶液调节pH至11 ~ 13，继续搅拌10 ~ 20分钟后将此溶液转入高压反应釜，于160 ~ 200 °C反应12 ~ 24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到锡酸铋材料；（2）硫化镉材料的制备取0.4 ~ 0.5 g九水合硫化钠溶解于20 ~ 40 mL水中，搅拌5 ~ 10分钟，此溶液作为溶液A；取0.5 ~ 0.6 g乙酸镉溶解于20 ~ 40 mL水中，搅拌5 ~ 10分钟，此溶液作为溶液B；将溶液A和溶液B混合，室温下搅拌1 ~ 2小时后将混合溶液转入高压反应釜，于160 ~ 180 °C反应20 ~ 24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到硫化镉产品；（3）二氧化硅纳米材料的制备取70 ~ 80 mL无水乙醇和3 ~ 5 mL超纯水混合，搅拌均匀，向该溶液加入6 ~ 8 mL正硅酸四乙酯溶液，搅拌5 ~ 10分钟后，将15 ~ 20 mL质量分数为25 %的氨水溶液以1 ~ 3mL/min的速率滴入上述溶液，于40 °C下搅拌3 ~ 5小时，之后离心除去溶剂，并用乙醇和超纯水洗涤至中性，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥10 ~ 16小时，得到二氧化硅纳米材料；（4）二氧化硅的胺化取2 ~ 4 mL APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）和1 ~ 2 g制备的二氧化硅加入100 ~200 mL无水甲苯中，溶液超声20 ~ 30分钟后，将该溶液置于80 ~ 100 °C下搅拌20 ~ 24小时，然后用乙醇和超纯水离心洗涤至中性，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到胺化的二氧化硅粉末；（5）PBS缓冲溶液的配置取7.0980 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1 M.的水溶液，作为甲液；取6.8045 g 无水磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1M.的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；（6）乙酰胆碱酯酶-胺化二氧化硅-降钙素原二抗的制备取1 ~ 2 mL的5 mg/mL胺化的二氧化硅加入到0.5 ~ 1.0 mL质量分数为2.5 %的戊二醛中，室温下搅拌6小时，离心后用pH为7.4的PBS洗涤除去戊二醛，然后将离心后的产品溶于1 mL、pH为7.4的PBS中并加入200 ~ 400 μg/mL的降钙素原二抗和200 ~ 400 μL浓度为1~ 5 mg/mL的乙酰胆碱酯酶，将溶液于37 °C下剧烈震荡1小时，并离心洗涤，将洗涤后得到的产品分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，同时加入50 ~ 80 μL质量分数为1 ~ 3 %的BSA溶液（pH为7.4的PBS缓冲液配置），以此来封闭非特异性活性位点，然后在室温下剧烈振荡1小时，离心并洗涤，最后将离心后得到的产品分散于5 mL、pH为7.4的PBS溶液中，并于4 °C下保存；（7）光电化学传感器的制备 1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，在70 °C烘箱中烘干140分钟； 2）取8 ~ 10 µL、2 ~ 6 mg/mL的锡酸铋水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，红外灯下晾干； 3）在修饰的电极表面继续滴加8 ~ 10 µL、2 ~ 6 mg/mL的硫化镉水溶液，电极于室温下自然晾干； 4）取50 µL浓度为5 ~ 20 μg/mL的降钙素原捕获抗体滴入96微孔板中，于4 °C条件下放置10 ~ 14小时以保证抗体与96微孔板牢固结合，抗体孵化结束后，吸出未结合的降钙素原抗体，用PBS缓冲溶液小心清洗96微孔板； 5）取25 µL用PBS配制的质量分数在1 ~ 3 %的牛血清白蛋白滴于96微孔板中，于室温下孵化1小时，之后吸出未结合的牛血清白蛋白，用PBS清洗96微孔板； 6）取50 µL浓度为0.0005 ~ 100 ng/mL的降钙素原抗原滴于96微孔板中，在室温下孵化1小时，之后用PBS缓冲溶液清洗96微孔板； 7）取50 µL二氧化硅与降钙素原二抗和乙酰胆碱酯酶连接复合物滴于96微孔板中，室温下孵化1 小时后，用PBS缓冲溶液冲洗96微孔板； 8）取50 µL用PBS缓冲溶液配制的浓度为1 ~ 5mg/mL的碘化乙酰硫代胆碱滴入96微孔板中，作用10 ~ 30 分钟； 9）将96微孔板中的溶液吸出，注入10 mL的pH为7.4的PBS缓冲溶液中作为光电测试的电解质溶液，将修饰的硫化镉/锡酸铋/导电玻璃电极浸入该电解质溶液中，制得一种检测降钙素原的光电化学传感器。 2.如权利要求1所述制备的光电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的ITO修饰电极为工作电极，在含有从96微孔板吸出的溶液的pH为5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液中进行测试；（2）将所修饰的电极浸入含有从96微孔板中吸出的不同的溶液的PBS缓冲溶液中，利用时间-电流法进行测试，设置电压为-0.1 ~ 0.1 V，运行时间120 s，光源波长为小于750 nm的白光；（3）电极放置好之后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测。
所属类别：	发明专利