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原文传递一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用

专利名称：	一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用
摘要：	一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条及其制备方法与应用，属于荧光免疫检测技术领域。为了更快速、稳定、准确检测旋毛虫感染，本发明提供了一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG；所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML‑ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML‑ESP抗原组成的旋毛虫肌幼虫ES混合抗原；所述质控线上喷涂有兔抗山羊IgG，将上述各组分组合后制备成试纸条，本发明可用于猪旋毛虫病的快速检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	吉林大学
发明人：	刘明远;刘晓雷;杨勇;王学林;白雪;唐斌;丁静;王楠;张小波
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910604044.8
公开号：	CN110221066A
代理机构：	哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
代理人：	邓宇
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	130022 吉林省长春市前进大街2699号
主权项：	1.一种旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，其特征在于，所述结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG；所述样品垫上设置有加样孔；所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂有旋毛虫肌幼虫ES混合抗原，所述旋毛虫肌幼虫ES混合抗原由旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原与旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原组成；所述质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。 2.根据权利要求1所述的旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述样品垫材质为玻璃纤维素膜XQ-Y8；所述结合垫材质为玻璃纤维素膜Ahistrom8964；所述层析膜材质为硝酸纤维素膜Millipore135。 3.权利要求1所述的旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 1)旋毛虫肌幼虫ES混合抗原制备：将旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原及旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原，按照1:1的质量比混合，获得旋毛虫肌幼虫ES抗原； 2)结合垫的制备：将时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG喷涂在结合垫上，真空抽干后干燥保存备用； 3)检测线和质控线的制备：将旋毛虫肌幼虫ES混合抗原与兔抗山羊IgG按照1:0.625的质量比，分别喷涂在层析膜上，形成检测线与质控线，37℃干燥2-3h，使用封闭剂浸泡干燥后的层析膜1-2h，随后37℃干燥1-2h，密封保存备用； 4)试纸条的组装：在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫粘贴在底板上，制成试纸条。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原的制备方法如下：将旋毛虫肌幼虫用含有青霉素和链霉素的培养液洗涤后自然沉淀20-30min，然后将其放入含终浓度250U/mL青霉素和终浓度为250U/mL链霉素的培养液中，密度为3000-5000条/mL，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清，收集的上清依次经透析及3KDa超滤管浓缩后即为旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ML-ESP抗原。 5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原的制备方法如下：将旋毛虫肌幼虫经口感染大鼠，剂量为8000条/只，6h后处死，取出大鼠小肠，切割成碎片，放置于含有培养液的培养皿筛网上，37℃孵育2-3h，收集培养皿底部的虫体，用含有青霉素和链霉素的培养液洗涤后自然沉淀20-30min，然后将其放入含终浓度250U/mL青霉素和终浓度为250U/mL链霉素的培养液中，密度为3000-5000条/mL，37℃，10％二氧化碳，培养18-24h后收集上清，收集的上清依次经经透析及3KDa超滤管浓缩后即为旋毛虫肠道期肌幼虫排泄分泌物iML-ESP抗原。 6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG的制备方法如下：每100μL 1％(w/v)的时间分辨荧光微球中加入0.05mol/L2-吗啉乙磺酸MES溶液400μL，16mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺NHS 50μL和8mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC 50μL混匀，室温孵育1-2h；反应结束离心后弃上清，使用磷酸盐缓冲液漂洗沉淀后加入500μL磷酸盐缓冲液重悬；然后，加入40μL的5mg/mL山羊抗猪IgG，室温孵育1-2h；然后，加入100μL的0.1mol/L甘氨酸溶液，室温孵育30-60min，离心后弃上清，向沉淀中加入8000μL偶联储存液重悬即得；所述偶联储存液为0.05mol/L PBS溶液，每升偶联储存液中含有Proclin300，0.5mL，BSA10g，聚乙二醇400，20g。 7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述喷涂，点样速度为50μL/cm。 8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述喷涂，点样速度为1μL/cm。 9.权利要求1所述的旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条在旋毛虫病检测中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将待测血清用样品稀释液稀释后，加入到试纸条加样孔中，室温静置5～10min，用紫外灯照射试纸条观察结果，待测样品如果质控线和检测线均显色，则判定为阳性；如果仅质控线显色，而检测线不显色，则判定为阴性。
所属类别：	发明专利