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原文传递一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡及制备方法和应用

专利名称：	一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡及制备方法和应用
摘要：	本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；荧光垫内有荧光标记抗ASFV p30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFV p30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。适用于发病猪外周血、血清、唾液、组织(肺脏、脾脏)研磨液内ASFV p30抗原的检测，在短时间内诊断出ASFV感染，特别适合现场ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验；与免疫荧光分析仪协同使用直接显示结果，操作迅速简单、准确率高，具有很强的实用性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	扬州大学
发明人：	张鑫宇;刘潇羽;党红军;熊新灿;孙怀昌
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201910427204.6
公开号：	CN110196323A
代理机构：	南京纵横知识产权代理有限公司
代理人：	严晓彪;董建林
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	225009 江苏省扬州市大学南路88号
主权项：	1.一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；荧光垫内有荧光标记抗ASFV p30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFV p30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。 2.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，所述抗ASFV p30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的抗原表位均位于p30aa145-aa154，且体Mab1和Mab2具体针对的表位不同。 3.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于武汉大学保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于武汉大学保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5。 4.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，检测线的Mab2工作浓度为1.0mg/mL，质控线的羊抗鼠IgG抗体工作浓度为1.0mg/ml，Mab2抗体和羊抗鼠IgG抗体划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离为5mm。 5.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡的制备方法，其特征在于，荧光标记抗ASFV p30抗原的单克隆抗体Mab1，包括以下步骤： S1、将未处理的荧光垫浸泡于处理液中，取出后，恒温干燥，制得预处理的荧光垫； S2、将铕荧光微球加入EDC溶液中，振荡活化荧光微球； S3、于纯化单克隆抗体Mab1中，加入标记液缓冲液，混合均匀后，加入活化的荧光微球，恒温振荡； S4、平衡PD MiniTrap G-25脱盐柱后，制得标记的荧光微球溶液； S5、将标记的荧光微球溶液喷至预处理的荧光垫上，恒温干燥。 6.根据权利要求5所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的处理液包括：0.02M PBS缓冲液，pH 7.2、3％蔗糖、0.1％PEG20000、0.5％BSA、0.5％Tween-20；浸泡时间为30min，干燥温度为37℃；所述步骤S2中的铕荧光微球为1mg 200nm；EDC溶液为100μL 40mg/ml，振荡时间为1min；所述步骤S3中的纯化单克隆抗体Mab1为1mg，标记液缓冲液为1M MES，pH5.0，10μl；加入活化的荧光微球为12μL，恒温振荡时间为1h；所述步骤S5中标记的荧光微球溶液的喷量为5μL/cm，干燥温度为37℃。 7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： A1、将PVC底板粘面朝上，将硝酸纤维素膜粘在PVC板中间位置， A2、将荧光垫粘附于硝酸纤维素膜前； A3、在荧光垫前、硝酸纤维素膜后分别将样品垫、吸水垫粘附在PVC底板上，制得试纸条； A4、将试纸条置于带加样孔的外壳内，组装成试纸卡；所述加样孔正对样品垫。 8.根据权利要求7所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡的制备方法，其特征在于，所述样品垫与荧光垫、荧光垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸水垫部分叠合，且叠合宽度为2mm；试纸条的宽度为3.5mm。 9.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，使用时，将1滴待检样品滴加于试纸卡的加样孔，加入3滴样品稀释液，室温静置后，插入便携免疫荧光分析仪，通过收集及分析免疫荧光分析仪检测到的荧光信号，转换成检测值；若检测值＞29.49，则结果判定为阳性，表明样品中存在ASFV抗原；若检测值≤29.49，则结果判定为阴性，表明样品中无ASFV抗原。 10.根据权利要求9所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，所述样品稀释液包括0.8％氯化钠，0.05％BSA，0.5％Tween-20；室温静置时间为10min。
所属类别：	发明专利