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原文传递快速检测降钙素原的均相免疫试剂盒、制备方法、检测方法和装置

专利名称：	快速检测降钙素原的均相免疫试剂盒、制备方法、检测方法和装置
摘要：	本发明涉及免疫分析技术领域的一种快速检测降钙素原的均相免疫试剂盒、制备方法、检测方法和装置。由本发明所述方法制备的快速检测降钙素原的均相免疫试剂盒能够快速检测待测样本中的降钙素原，检测时间可缩短至10min以内，且检测灵敏度能达到20pg/mL、变异系数在10％以内。另外，采用本发明所述试剂盒进行检测时，可以减少试剂的用量、节省原料，且能准确、快速确定受治疗者的待测样本中降钙素原的含量，具有广阔的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	博阳生物科技(上海)有限公司
发明人：	孙小禁;杨阳;洪琳;赵卫国;刘宇卉;李临
专利状态：	有效
申请日期：	2018-02-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201810141464.2
公开号：	CN110161230A
代理机构：	北京聿宏知识产权代理有限公司
代理人：	吴大建;方莉
分类号：	G01N33/536(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	201210 上海市浦东新区自由贸易试验区蔡伦路88号五楼东面
主权项：	1.一种制备快速检测降钙素原的均相免疫试剂盒的方法，其包括：制备组分a，所述组分a为与第一抗体或其结合片段结合的能够与单线态氧反应生成可检测信号的受体；所述第一抗体或其结合片段能够与降钙素原的第一表位特异性结合；制备组分b，所述组分b为与生物素结合的第二抗体或其结合片段；所述第二抗体或其结合片段能够与降钙素原的第二表位特异性结合，且所述第二表位和所述第一表位不相重叠；制备组分c，所述组分c为与链霉亲和素结合的能够在激发状态产生单线态氧的供体。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一抗体和第二抗体分别独立地选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体结合片段、人工抗体或修饰的抗体；优选选自多克隆抗体和/或单克隆抗体；进一步优选为单克隆抗体。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述受体包含烯烃化合物和金属螯合物，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒；所述供体为光活化的或化学活化的敏化剂，其为非粒子形式，且在含水介质中可溶；和/或，所述供体为填充有感光化合物的高分子微粒。 4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一抗体或其结合片段与受体间接结合；优选地，所述第一抗体或其结合片段与受体通过异硫氰酸荧光素-异硫氰酸荧光素抗体系统间接结合。 5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述受体为醛基和/或羧基改性的受体；优选地，所述受体为羧基改性的受体。 6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：制备第一组合物，所述第一组合物包括所述组分a和第一缓冲液；制备第二组合物，所述第二组合物包括所述组分b和第二缓冲液；制备第三组合物，所述第三组合物包括所述组分c和第三缓冲液。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一组合物中组分a的浓度为50～300μg/mL；优选为80～250μg/mL；更优选为100～200μg/mL；和/或，所述第二组合物中组分b的浓度为1～15μg/mL；优选为2～10μg/mL；更优选为4～8μg/mL；和/或所述第三组合物中组分c的浓度为20～200μg/mL；优选为30～150μg/mL；更优选为50～100μg/mL。 8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述受体为填充有发光化合物和镧系元素的高分子微粒，且所述第一组合物的制备方法包括：步骤S1，第一抗体或其结合片段利用第一透析缓冲液进行透析，获得透析后的第一抗体或其结合片段；步骤S2，用交联缓冲液对受体进行清洗后，再用交联缓冲液对清洗后的受体重悬，获得受体液；步骤S3，在受体液中加入透析后的第一抗体或其结合片段混匀，进行结合，获得与第一抗体或其结合片段结合的受体；步骤S4，用清洗缓冲液对与第一抗体或其结合片段结合的受体进行清洗后，加入第一缓冲溶液获得第一组合物。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一抗体或其结合片段与受体的质量比为(0.1～0.9):10；优选地，所述第一抗体或其结合片段与受体的质量比为(0.2～0.8):10；更优选为(0.3～0.7):10。 10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述第一透析缓冲液和交联缓冲液均为pH值为9.5～10.0的0.03～0.08M的CB缓冲液；所述清洗缓冲液为pH值为7.0～7.5的0.08～0.12M的PBST缓冲液。 11.根据权利要求6-10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第二组合物的制备方法包括：步骤T1，第二抗体或其结合片段利用标记缓冲液进行透析，获得透析后的第二抗体或其结合片段；步骤T2，在透析后的第二抗体或其结合片段中加入标记缓冲液混匀，然后加入生物素物溶液混匀，旋转过夜，获得与第一标记物结合的第二抗体或其结合片段；步骤T3，与第一标记物结合的第二抗体或其结合片段利用第二透析缓冲液进行透析，透析结束后加入第二缓冲液，获得第二组合物。 12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述标记缓冲液为pH值为7.5～8.5的0.08～0.12M的NaHCO3溶液；所述第二透析缓冲液为pH值为7.0～7.5的0.08～0.12M的PBS缓冲液。 13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述第一标记物与第二抗体或其结合片段的质量比为1:(10～100)；优选地，所述第一标记物与第二抗体或其结合片段的质量比为1:(20～90)；更优选为1:(30～80)。 14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲溶液和第二缓冲溶液均为pH值为7.0～8.0的0.08～0.12M的Tris-HCl溶液。 15.根据权利要求1-14中任意一项所述的方法，其特征在于，所述第三组合物中还包含表面活性剂；优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂；进一步优选地，所述表面活性剂为直链型非离子表面活性剂。 16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂的浓度为0.01-0.04wt％；优选为0.02-0.04wt％。 17.一种由权利要求1-16中任意一项所述的方法制备得到的快速检测降钙素原的均相免疫试剂盒。 18.一种采用如权利要求17所述的试剂盒快速检测降钙素原的均相免疫方法，所述方法为光激化学发光检测。 19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤R1，将V1体积待测样本与V2体积第一组合物和V3体积第二组合物混合后进行第一反应，以得到第一混合物；控制所述第一反应的温度为K1以及反应的时长为T1；步骤R2，将第一混合物与第三组合物混合后进行第二反应，以得到第二混合物；控制所述第二反应的温度为K2，反应的时长为T2；步骤R3，使能量或者活性化合物激发第二混合物中的供体产生单线态氧，所述受体能够与接收到的单线态氧反应生成可检测的化学发光信号；通过检测化学发光信号的存在和/或强度，从而判断测待测样品中是否存在降钙素原和/或确定降钙素原的含量；其中，T1≤15min，T2≤5min，且T1+T2≤15min。 20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤R1中，先将待测样本与所述第一组合物混合后再加入第二组合物。 21.根据权利要求19或20中所述的方法，其特征在于，所述K1和K2分别独立地选自35～45℃；优选选自37～42℃。 22.根据权利要求19-21中任意一项所述的方法，其特征在于，所述T1≤12min；优选地，所述T1≤10min；进一步优选地，6min≤T1≤10min。 23.根据权利要求19-22中任意一项所述的方法，其特征在于，所述T2≥2min。 24.根据权利要求19-23中任意一项所述的方法，其特征在于，所述T1+T2≤13min；优选地，所述T1+T2≤12.5min；进一步优选地，所述T1+T2≤10min。 25.根据权利要求19-24中任意一项所述的方法，其特征在于，所述T1为8min，T2为2min。 26.根据权利要求19-25中任意一项所述的方法，其特征在于，5μL≤V1≤100μL；优选地，10μL≤V1≤80μL；更优选地，20μL≤V1≤60μL。 27.根据权利要求19-26中任意一项所述的方法，其特征在于，5μL≤V2≤50μL；优选地，8μL≤V2≤40μL；更优选地，10μL≤V2≤25μL。 28.根据权利要求19-27中任意一项所述的方法，其特征在于，5μL≤V3≤50μL；优选地，8μL≤V3≤40μL；更优选地，10μL≤V3≤25μL。 29.根据权利要求19-28中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤R3中，使用600-700nm波长的激发光照射第二混合物，激发供体产生单线态氧，受体与接触到的单线态氧反应生成520-620nm的发射光，通过检测发射光信号的存在和/强度，从而判断测待测样品中是否存在降钙素原和/或确定降钙素原的含量。 30.根据权利要求18-29中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法的灵敏度为20pg/mL。 31.一种快速检测降钙素原的均相免疫检测装置，其采用如权利要求17所述的试剂盒或如权利要求18-30中任意一项所述的方法检测待测样本中的降钙素原。 32.根据权利要求31所述的装置，其特征在于，所述装置包括：加样模块、试剂模块、温育模块、检测模块以及电路控制模块；所述加样模块、试剂模块、温育模块和检测模块均与所述电路控制模块电连接。 33.根据权利要求32所述的装置，其特征在于，所述试剂模块包括用于加入第一组合物的第一组件以及用于加入第二组合物的第二组件。 34.一种如权利要求17所述的试剂盒、如权利要求18-30中任意一项所述的方法或如权利要求31-33中任意一项所述的装置在POCT检测技术中的应用。 35.一种如权利要求1-16中任意一项所述的方法在制备用于检测疑似患有细菌性脓毒症、急性重症胰腺炎及相关并发症和呼吸道相关炎症及感染的受治疗者的待测样本中的降钙素原，由此确定所述待测样本中降钙素原的水平的试剂盒中的应用；优选地，所述待测样本为血清或血浆。
所属类别：	发明专利