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原文传递一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒及其检测方法

专利名称：	一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒及其检测方法
摘要：	本发明提供了一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其能解决现有疫苗的效力检测方法费时费力，并且需要免疫的技术问题。一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：ELISA抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。该试剂盒将疫苗中蛋白含量与对照样品进行比较，无需对试验动物进行免疫。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏南农高科技股份有限公司
发明人：	缪芬芳;肖澄;董彦鹏;徐凤;胡静雅;车巧林;周琳;耿晓眉;谢洁
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-09T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910385538.1
公开号：	CN110208542A
代理机构：	北京卓岚智财知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	任漱晨
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	214405 江苏省无锡市江阴市锡澄路890号
主权项：	1.一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述ELISA抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；所述包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；所述对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，所述猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。 2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述猪圆环病毒2型灭活培养物由以下方法制得：将猪圆环病毒2型毒种接种于PK细胞的培养瓶中，置37℃下吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃下旋转培养，转速为10～12转/小时，培养4日后，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物并留样作病毒含量测定，将检验合格的病毒液加入β-丙酰内酯灭活，使其终浓度为0.1％，随即充分混匀，4℃20小时，37℃振摇2小时，得到所述猪圆环病毒2型灭活培养物。 3.根据权利要求2所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述猪圆环病毒2型抗原的包被浓度为0.05-5μg/ml，包被稀释液为0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液。 4.根据权利要求3所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控血清为所述猪圆环病毒2型全病毒蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔后采集血清，经MAB SELECT纯化所得，稀释比例为1:1000-1:4000；所述阴性质控血清为健康新西兰大白兔的血清经MAB SELECT纯化后所得，清稀释比例为1:50-1:500。 5.根据权利要求4所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，稀释浓度为1:1000-1:20000，稀释液为含有0.1-5％(W/V)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(V/V)ProClin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。 6.根据权利要求5所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为含有0.1-5％(W/V)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(V/V)ProClin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。 7.根据权利要求6所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为10倍的浓缩洗涤液，所述10倍的浓缩洗涤液为含有0.5％(V/V)吐温-20的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。 8.根据权利要求7所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述显色液为TMB底物显色液。 9.根据权利要求8所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述终止液为2mol/L的H2SO4。 10.权利要求9中所述ELISA抗原检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤： (1)向包被板分别加入1：2稀释的待检样品、1：2稀释的对照样品各一列，每孔50μl； (2)向包被板剩余列中分别加入1:2稀释的阴性质控血清一列、1:2稀释的阳性质控血清一列，作为对照，每孔100μl； (3)向包被板的待检样品、对照样品列中加入阳性质控血清，每孔50μl，盖好包被板； (4)包被板置37℃反应1小时； (5)倒掉孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子； (6)每孔加入100μ1辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，酶标板置37℃反应1小时； (7)倒掉孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子； (8)每孔加入100μ1TMB底物显色液，室温显色15分钟； (9)每孔加入50μ1终止液，10分钟内在酶标仪上读取OD450nm值； (10)结果计算：阴性质控血清1:2稀释对照孔OD450nm值＜0.4，阳性质控血清1:2稀释对照孔OD450nm值＞1.0，待检疫苗与对照样品测定的OD450nm值采用RelPot4.0软件进行相对效力RP值计算，当RP值大于1.0则待检疫苗合格。
所属类别：	发明专利