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原文传递一种检测血液中维生素K2含量的方法

专利名称：	一种检测血液中维生素K2含量的方法
摘要：	本发明提供了一种检测血液中维生素K2含量的方法，该方法包括：利用高效液相串联质谱仪检测至少三个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，该标准溶液含浓度已知的维生素K2和内标物；以标准溶液中维生素K2与内标物的浓度比值为一二维坐标，以该标准溶液的色谱图中，两者峰面积比值为另一二维坐标，拟合得到标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品，并加入浓度已知的内标物，经样品前处理以得到待测样品；在相同检测条件下检测待测样品得到色谱图；将该色谱图中维生素K2和内标物的峰面积比值代入到标准曲线方程中，并根据所添加内标物的浓度，计算出待检测血液中维生素K2的含量。本发明能够准确检测血液中的维生素K2含量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	许丽;雒琴;贾永娟;倪君君
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910629525.4
公开号：	CN110208436A
代理机构：	济南信达专利事务所有限公司
代理人：	李世喆
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市北京经济技术开发区经海六路5号院14号楼1层、2层、3层、5层、6层、7层
主权项：	1.一种检测血液中维生素K2含量的方法，其特征在于，包括：利用高效液相串联质谱仪，在一定检测条件下，分别检测N个标准溶液，得到各个标准溶液的色谱图，其中，任一标准溶液中均含有浓度已知的维生素K2和浓度已知的内标物，不同标准溶液中维生素K2的浓度不同，且N≥3；以标准溶液中，维生素K2的浓度与内标物的浓度的比值为一二维坐标，以及以该标准溶液的色谱图中，维生素K2的峰面积和内标物的峰面积的比值为另一二维坐标，拟合得到标准曲线方程；处理待检测血液得到血液样品；将一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品；利用高效液相串联质谱仪，在相同检测条件下，检测所述待测样品，得到所述待测样品的色谱图；将所述待测样品的色谱图中，维生素K2的峰面积和内标物的峰面积的比值，代入到所述标准曲线方程中，并根据所添加的内标物的浓度，计算出所述待检测血液中维生素K2的含量；其中，所述标准曲线方程为：y＝k×x+b，其中，y表征峰面积比值，x表征浓度比值，k和b均表征系数。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测条件包括：液相条件和串联质谱条件；其中，所述液相条件包括：色谱柱的长度为50mm、内径为3.0mm、填料粒径为2.7μm，流动相为含体积比为0.05％-0.25％甲酸的纯水和含体积比为0.05％-0.25％甲酸的甲醇，分析时间为7.5min，柱温为27℃-33℃，进样量为10μL-30μL，流速为0.55mL/min-0.65mL/min；其中，所述串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源APCI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，干燥气温度为300℃，干燥气流速为6L/min，雾化气压力为20psi，毛细管电压为4500V。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液相条件还包括：Poroshell 120 EC-C18色谱柱；和/或，所述液相条件包括：柱温为30℃；和/或，所述液相条件包括：流动相为含体积比为0.2％甲酸的纯水和含体积比为0.2％甲酸的甲醇，流速为0.6mL/min；洗脱过程为：含甲酸的甲醇和含甲酸的纯水的百分用量比，在4.1min-6.0min的洗脱时间范围内为99-100：1-0，在其他洗脱时间范围内为90-98：10-2。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，添加到所述血液样品中，并进行样品前处理以得到待测样品，包括：用移液枪移取一定量的含有浓度已知的内标物的内标工作液，置于离心管中，再加入50μL-300μL所述血液样品，再加入一定量的沉淀蛋白试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合2min-5min；涡旋混合后在离心管中加入一定量的萃取试剂，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合3min-10min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min；移取一定量离心后的上清液至离心管中，并转移至氮气吹干装置上以将上清液吹干；移取一定量的复溶液至上清液吹干的离心管中，在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混合1min-3min，再在10000rpm-15000rpm的转速下高速离心4min-6min，得到待测样品。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述内标工作液的移取量为10μL；和/或，所述沉淀蛋白试剂为乙醇，乙醇的用量为100μL-500μL；和/或，所述萃取试剂为正己烷，正己烷的用量为800μL-1200μL；和/或，所述复溶液为含体积比为0.05％-0.25％甲酸的乙腈，或，含体积比为0.05％-0.25％甲酸的甲醇，所述复溶液的用量为50μL-200μL。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述处理待检测血液得到血液样品，包括：取一定量的待检测血液，经离心，取上清液以作为血液样品。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待检测血液的用量不少于5mL；离心速度为3500rpm；离心持续时长为10min；所述血液样品的保存条件为，置于-20℃下保存直至分析前备用。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述分别检测N个标准溶液之前，进一步包括：利用移液器移取10μL标准工作液、10μL所述内标工作液和80μL乙腈至离心管中，其中，标准工作液中含有浓度已知的维生素K2；将该离心管在1500rpm-2500rpm的转速下涡旋混匀1min-2min后，移取上清液以得到标准溶液。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述得到标准溶液之前，进一步包括：精确称取10mg的维生素K2的标准品，并置于10mL容量瓶中，用甲醇进行溶解并定容，以得到标准储备液，并在-80℃下保存，有效期为6个月；取一定量的所述标准储备液置于一定体积的容量瓶中，用85％-95％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述标准工作液，且所述标准工作液中维生素K2的浓度介于0.5ng/mL-100ng/mL之间，并在-80℃下保存，有效期为3个月；取2mg的内标物，该内标物为维生素K2的同位素内标物，并置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解并定容，以得到内标储备液，并在-80℃下保存，有效期为1年；取一定量的所述内标储备液置于一定体积的容量瓶中，用90％的甲醇水溶液进行稀释并定容，以得到所述内标工作液，并在-80℃下保存，有效期为1年。 10.根据权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于，内标物为维生素K2的同位素内标物；和/或，所述N个标准溶液中维生素K2的浓度包括：0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL中的至少三个。
所属类别：	发明专利