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原文传递检测血液中维生素K1含量的液质分析方法

专利名称：	检测血液中维生素K1含量的液质分析方法
摘要：	本发明检测血液中维生素K1含量的液质分析方法是使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中维生素K1的相对浓度x，内标物工作液中维生素K1同位素浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的维生素K1的浓度，本发明血清样本经液液萃取前处理后进样分析，检测过程简便快速，检测灵敏度高，更利于在临床治疗中对患者体内的维生素K1含量进行测定。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	刘春冉;佟洪梅;贾永娟;倪君君
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201910287337.8
公开号：	CN109959740A
代理机构：	北京双收知识产权代理有限公司
代理人：	解政文
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市大兴区经济技术开发区经海六路5号东尚E园14号楼
主权项：	1.一种检测血液中维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：它包括以下步骤： (一)、标准溶液的标定 (a)、标准工作液的配制：精确称维生素K1标准品15.46mg置于10mL容量瓶中，用10mL纯甲醇溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为5％-15％的甲醇溶液进行稀释，分别在含有0.5-5000ng/mL维生素K1的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存； (b)、标准内标液的配制：精确称取维生素K1同位素内标标准品1.00mg于1mL容量瓶中，用1mL纯甲醇溶解并定容至刻度，得到内标储备液B，将内标储备液B用含水量为5％-15％的甲醇溶液进行稀释，得到含有维生素K1同位素的浓度为10ng/mL的标准内标液，并在-80℃条件下保存； (c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液，将上述至少三种不同浓度的标准工作液分别与10μL的标准内标液和80μL替代基质混合，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，并置于2.0mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，向上述离心管中加入200-400μL的甲醇，并在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀3-5min，再向上述离心管中加入400-800μL的正己烷，并在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀5-10min，然后在转速为12000-14000rpm下离心5-10min，得到上清液，分别移取400-550μL上述上清液置于另一个离心管中，在常温下用氮气吹10min-20min直至上述上清液全部被吹干后，向吹干的离心管中分别加入100μL复溶液，该复溶液是含有0.05％-2％的甲酸和含有5％-15％水的甲醇溶液，在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，再在转速为12000-14000rpm下离心5-10min得上清液，分别取上述上清液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述上清液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的维生素K1色谱图和对应的维生素K1同位素色谱图，以上述至少三个标准溶液的维生素K1峰面积与对应的维生素K1同位素峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有维生素K1的浓度与标准内标液中含有维生素K1同位素浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝ax+b，并且得出权重系数a和b； (二)、检测血液的离心取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血清，将上述血清置于-80℃冷冻下保存至分析前备用； (三)、待测样品处理 (d)、用移液枪移取步骤(c)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的100uL的血清于上述离心管中，在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min，然后向上述离心管中加入200-400μL甲醇，并在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀3-5min后，再向上述离心管中加入400-800μL正己烷，在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀5-10min后，再在转速为12000-14000rpm下离心5-10min，得到上清液，分别移取400-550μL上述上清液置于另一个离心管中，在常温下用氮气吹10min-20min直至上述上清液全部被吹干后，向吹干的离心管中加入100μL复溶液，该复溶液是含有0.05％-2％的甲酸和含有5％-15％水的甲醇溶液，在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，再在转速为12000-14000rpm下离心5-10min，得到的液体即为待测样品； (四)、待测样品的检测移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的维生素K1色谱图和维生素K1同位素色谱图，将上述色谱图中的维生素K1峰面积和维生素K1同位素峰面积之比y代入上述步骤(c)的标准曲线方程y＝ax+b中，通过计算得到待检测样品中维生素K1浓度与标准内标液中维生素K1同位素浓度之比x，标准内标液中维生素K1同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的维生素K1浓度。 2.如权利要求1所述的检测血液中维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中使用九种不同浓度的标准工作液，九种不同浓度的标准工作液分别为含有0.5、1、2、5、20、100、500、2000和5000ng/mL浓度的维生素K1溶液。 3.如权利要求2所述的检测血液中维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白在100mL生理盐水中，通过超声溶解而制成的。 4.如权利要求3所述的检测血液中维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(a)和(b)中所述的甲醇溶液是由10:90的水和甲醇组成的。 5.如权利要求4所述的检测血液中维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)和步骤(d)所述的复溶液是由比例为0.1:10:89.9的甲酸、水和甲醇组成的复溶液。 6.如权利要求5所述的检测血液维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)和步骤(d)中，所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Poroshell 120-SB-C18，所使用的在线过滤器为1290 Infinity In-line Filter，高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪设置的柱温为40℃，进样量为20μL。 7.如权利要求6所述的检测血液中维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相含有4:96比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。 8.如权利要求7所述的检测血液中维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的离子源为APCI源，采集方式为正离子采集，定量离子对为451.20-186.60。 9.如权利要求8所述的检测血液中维生素K1含量的液质分析方法，其特征在于：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
所属类别：	发明专利