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原文传递检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法

专利名称：	检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法
摘要：	本发明检测血液中17‑羟孕酮含量的在液相色谱串联质谱分析方法是使用高效液相色谱串联质谱仪对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用高效液相色谱串联质谱仪对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中17‑羟孕酮相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的17‑羟孕酮浓度，本发明血清经萃取离心后氮吹复溶进样，检测过程简便快速，实验成本降低，更利于在临床治疗中对患者体内的17‑羟孕酮浓度进行监测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	赵金宝;佟洪梅;倪君君;贾永娟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910287349.0
公开号：	CN109932454A
代理机构：	北京双收知识产权代理有限公司
代理人：	解政文
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市大兴区经济技术开发区经海六路5号东尚E园14号楼
主权项：	1.一种检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤： (一)、标准溶液的标定 (a)、标准工作液的配制：精确称取17-羟孕酮标准品2.02mg置于1mL容量瓶中，用1mL甲醇进行溶解，得到标准储备液A，其17-羟孕酮的浓度为1979.6μg/mL，将标准储备液A用含水量为10％-40％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有0.9-656.1ng/mL17-羟孕酮浓度的范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存； (b)、标准内标液的配制：取13C3-17-羟孕酮内标储备液B，其13C3-17-羟孕酮浓度为100μg/mL，将内标储备液B用含水量为10％-40％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到含有13C3-17-羟孕酮浓度为50ng/mL的标准内标液，并在-80℃条件下保存； (c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液，将上述至少三种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和80μL复溶液混合，该复溶液是含水量为40％-80％的乙腈溶液，并置于1.5mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，用高效液相色谱串联质谱仪分别对上述标准溶液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的17-羟孕酮色谱图和其对应的标准内标液中的13C3-17-羟孕酮色谱图，以上述至少三个标准溶液的17-羟孕酮峰面积和其对应的标准内标液中的13C3-17-羟孕酮峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有17-羟孕酮的浓度与标准内标液中含有13C3-17-羟孕酮浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝ax+b，并且得出权重系数a和b； (二)、检测血液的离心取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血清，将上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用； (三)、待测样品处理 (d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的300μL的血清于上述离心管中,在离心速度为1500-2500rpm下离心30s-1min后；在上述离心管中加入甲基叔丁基醚萃取剂1000μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀5-15min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液，然后取上述上清液900μL，在氮吹仪中吹干，用含水量为40％-80％的乙腈溶液的复溶液进行复溶即为待测样品； (四)、待测样品的检测移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的17-羟孕酮色谱图和其对应的标准内标液中的13C3-17-羟孕酮色谱图，将上述色谱图中的17-羟孕酮峰面积和其对应的标准内标液中的13C3-17-羟孕酮峰面积之比y代入上述步骤(c)的标准曲线方程y＝ax+b中，通过计算得到待检测样品中17-羟孕酮浓度与标准内标液中13C3-17-羟孕酮浓度之比x，标准内标液中13C3-17-羟孕酮浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的17-羟孕酮浓度。 2.如权利要求1所述的检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法，其特征在于：在步骤(c)中，使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有0.9、2.7、8.1、24.3、72.9、218.7和656.1ng/mL浓度的17-羟孕酮溶液。 3.如权利要求2所述的检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法，其特征在于：在步骤(一)中的稀释液是由3:7的水和甲醇组成的稀释液。 4.如权利要求3所述的检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法，其特征在于：在步骤(c)和步骤(d)中，所述复溶液是由1:1的水和乙腈组成的复溶液。 5.如权利要求4所述的检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Poroshell 120 SB-C18，分析色谱柱的柱温为30℃，进样量为30μL。 6.如权利要求5所述的检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的初始流动相含有35:65比例的乙腈和水，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。 7.如权利要求6所述的检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱串联质谱仪为岛津LC-MS8045高效液相色谱串联质谱仪，其中17-羟孕酮检测离子对为331.2>109.1，13C3-17-羟孕酮检测离子对334.2>112.1。 8.如权利要求7所述的检测血液中17-羟孕酮含量的液相色谱串联质谱分析方法，其特征在于：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
所属类别：	发明专利