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原文传递检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法

专利名称：	检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法
摘要：	本发明检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法是用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y1＝ax1+b、y2＝cx2+d和y3＝e*x3+f，在该待检测血液经过处理后，同样用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对待测的样品进行检测，得到待测血液y1、y2和y3值，将其代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液中儿茶酚胺三种物质的相对浓度x1、x2和x3，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该待检测血液中的儿茶酚胺三种物质浓度，本发明血浆经off‑line SPE处理后直接进样，使检测过程简便快速，检测灵敏度高，利于对患者体内儿茶酚胺含量进行测定。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	刘春冉;翟瑞雪;贾永娟;倪君君
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201910287327.4
公开号：	CN109959739A
代理机构：	北京双收知识产权代理有限公司
代理人：	解政文
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市大兴区经济技术开发区经海六路5号东尚E园14号楼
主权项：	1.一种检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：它包括以下步骤： (一)、标准溶液的标定 (a)、标准工作液的配制：精确称取去甲肾上腺素标准品3.2mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲肾上腺素的浓度为1324.5μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液A稀释得到标准中间液B，其去甲肾上腺素的浓度为6μg/mL；精确称取肾上腺素标准品2.80mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其肾上腺素的浓度为1400μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液C稀释得到标准中间液D，其肾上腺素的浓度为1.5μg/mL；精确称取多巴胺标准品1.15mg置于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶解并定容至刻度，得到标准储备液E，其多巴胺的浓度为928.9μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液E稀释得到标准中间液F，其多巴胺的浓度为300ng/mL；将标准中间液B、D和F以1:1:1的体积比混合后，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行稀释，在含有940-60000pg/mL去甲肾上腺素、240-15000pg/mL肾上腺素和50-3000pg/mL多巴胺的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存； (b)、标准内标液的配制精确称取去甲肾上腺素同位素内标标准品1.529mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液G，其去甲肾上腺素同位素的浓度为650μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液G稀释得到标准中间液H，其去甲肾上腺素同位素内标的浓度为1.35μg/mL；精确称取肾上腺素同位素内标标准品1.4mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液I，其肾上腺素同位素的浓度为700μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液I稀释得到标准中间液J，其肾上腺素同位素内标的浓度为300ng/mL；精确称取多巴胺同位素内标标准品5.78mg于2mL容量瓶中，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行溶解并定容至刻度，得到内标储备液K，其多巴胺同位素的浓度为2348.6μg/mL，用含有0.01％-2％甲酸稀释液从标准储备液K稀释得到标准中间液L，其多巴胺同位素内标的浓度为500ng/mL；将内标中间液H、J和L以2:1:1的体积比混合后，用含有0.01％-2％甲酸水溶液进行稀释，得到含有27ng/mL去甲肾上腺素同位素、含有3ng/mL肾上腺素同位素和含有5ng/mL多巴胺同位素浓度的标准内标液，并在-80℃条件下保存； (c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：用移液枪分别移取至少三种不同浓度的标准工作液10μL，将上述至少三种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和290μL替代基质混合，并置于1.5mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，在上述标准溶液中分别加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min；用100-300μL含有0.5％-2％甲醇的水溶液对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱，依次加入100-300μL含有1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵水溶液的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.5％-4％甲酸的洗脱液进行洗脱，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的色谱图及其对应的标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的峰面积和对应的标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺的浓度与对应的标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得至少九组数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝ax1+b、y2＝cx2+d和y3＝ex3+f并且得出权重系数a、b、c、d、e和f； (二)、检测血液的离心取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血浆，将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用； (三)待测样品处理 (d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的300uL的血浆于上述离心管中，加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液，在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min，用100-300μL含有0.5％-2％甲醇的水溶液对off-lineSPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，依次加入100-300μL含有1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵水溶液的洗涤液进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.5％-4％甲酸的洗脱液进行洗脱，得到的液体即为待测样品； (四)待测样品的检测移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的色谱图及其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的峰面积与其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素峰面积之比y1、y2和y3，代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝ax 1+b、y2＝cx2+d和y3＝ex3+f中，通过计算得到待检测样品中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的浓度与其对应标准内标液中的去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，，标准内标液中去甲肾上腺素同位素、肾上腺素同位素和多巴胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺的浓度。 2.如权利要求1所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：含有937.5pg/mL去甲肾上腺素、含有234.4pg/mL肾上腺素和含有46.875pg/mL多巴胺；含有1875pg/mL去甲肾上腺素、含有468.75pg/mL肾上腺素和含有93.75pg/mL多巴胺；含有3750pg/mL去甲肾上腺素、含有937.5pg/mL肾上腺素和含有187.5pg/mL多巴胺；含有7500pg/mL去甲肾上腺素、含有1875pg/mL肾上腺素和含有375pg/mL多巴胺；含有15000pg/mL去甲肾上腺素、含有3750pg/mL肾上腺素和含有750pg/mL多巴胺；含有30000pg/mL去甲肾上腺素、含有7500pg/mL肾上腺素和含有1500pg/mL多巴胺；含有60000pg/mL去甲肾上腺素、含有15000pg/mL肾上腺素和含有3000pg/mL多巴胺。 3.如权利要求2所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白溶解在100mL生理盐水中，通过超声溶解制成的；在步骤(a)和(b)中，所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液。 4.如权利要求3所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)和步骤(d)中，所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵的水溶液；所述洗涤液是含有20mmol/L乙酸铵的水溶液，所述洗脱液是由0.5:99.5的甲酸和水组成的洗脱液。 5.如权利要求4所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，SPE柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm的萃取柱，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi。 6.如权利要求5所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，所使用的在线过滤器为1290 Infinity In-line Filter，分析色谱柱的柱温为40℃，进样量为20μL。 7.如权利要求6所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相为含有98:2比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。 8.如权利要求7所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲肾上腺素152.1-107；肾上腺素184.1-107.1；多巴胺154.1-91.1。 9.如权利要求8所述的检测血液中儿茶酚胺含量的液质分析方法，其特征在于：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
所属类别：	发明专利