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原文传递检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法

专利名称：	检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法
摘要：	本发明检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法是用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对标准溶液进行标定，拟合出标准曲线方程为y1＝ax1+b、y2＝cx2+d和y3＝e*x3+f，在该待检测24H尿液经过处理后，同样使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对待测尿液进行检测，得到待测尿液y1、y2和y3值，将y1、y2和y3值代入标准曲线方程中，通过计算得到待测尿液中儿茶酚胺三种代谢物相对浓度x1、x2和x3，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该尿液中待检测24H尿液中的儿茶酚胺三种代谢物浓度，该方法检测过程简便快速，检测灵敏度高，利于对患者体内儿茶酚胺三种代谢物进行测定。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	刘春冉;翟瑞雪;倪君君;贾永娟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-06-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910287366.4
公开号：	CN109932455A
代理机构：	北京双收知识产权代理有限公司
代理人：	解政文
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市大兴区经济技术开发区经海六路5号东尚E园14号楼
主权项：	1.一种检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：它包括以下步骤： (一)标准溶液的标定 (a)、标准工作液的配制：精确称取去甲变肾上腺素标准品2.28mg置于2mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液A，其去甲变肾上腺素的浓度为912.75μg/mL；精确称取变肾上腺素标准品0.95mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液B，其变肾上腺素的浓度为78.53μg/mL；精确称取3-甲氧基酪胺标准品2.91mg置于10mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到标准储备液C，其3-甲氧基酪胺的浓度为230.86μg/mL；将标准储备液A、B和C以11:101.9:43.3的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸水溶液的稀释液进行稀释，在含有156.25-10000ng/mL去甲变肾上腺素、125-8000ng/mL变肾上腺素和156.25-10000ng/mL的3-甲氧基酪胺的范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存； (b)、标准内标液的配制：取去甲变肾上腺素同位素内标储备液D，其去甲变肾上腺素同位素的浓度为100μg/mL；取变肾上腺素同位素内标储备液E，其变肾上腺素同位素的浓度为100μg/mL；精确称取3-甲氧基酪胺同位素内标标准品0.42mg于5mL容量瓶中，用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度，得到3-甲氧基酪胺同位素内标储备液F，其3-甲氧基酪胺同位素的浓度为68.44μg/mL，将内标储备液D、E和F以3:3:1的体积比混合后，用含有0.01％-1％甲酸水溶液的稀释液进行稀释，得到含有1500ng/mL去甲变肾上腺素同位素、含有1500ng/mL变肾上腺素同位素和含有342.2ng/mL的3-甲氧基酪胺同位素的标准内标液，并在-80℃条件下保存； (c)、用标准溶液标定，得到标准曲线方程：用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液，将上述至少三种不同浓度标准工作液分别与10μL标准内标液和80μL替代基质混合，并置于1.5mL离心管中制成至少三种标准溶液，上述替代基质为含有4％的牛血清白蛋白，在上述标准溶液中分别加入5μL含有1-5mol/L盐酸的水解液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，在80-100℃条件下水浴20-30min，再依次加入5μL含有1-5mol/L氢氧化钠的中和液和100μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液；分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将处理好的上述标准溶液分别全部转移至SPE柱，然后用100-300μL水进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.05-1mol/L盐酸的洗脱液，分别取上述洗脱液100μL，用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，以上述至少三个标准溶液的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺峰面积与及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比分别作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3，以上述标准工作液中含有去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3，将以上检测所得到的至少九组数据分别进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝ax1+b、y2＝cx2+d和y3＝ex3+f，并且得出权重系数a、b、c、d、e和f； (二)检测尿液的采集收集24小时的尿液，在上述尿液中添加防腐剂，并置于-80℃冷冻下保存至分析前备用；其中在成人的尿液中添加10克硼酸或25毫升含有50％乙酸的水溶液作为防腐剂；在儿童的尿液中添加3克硼酸或15毫升含有50％乙酸的水溶液作为防腐剂： (三)待测样品处理 (d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中，然后加入步骤(二)的100uL的尿液于上述离心管中，加入5μL含有1-5mol/L盐酸的水解液，然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min，在80-100℃条件下水浴20-30min，再依次加入5μL含有1-5mol/L氢氧化钠的中和液和100μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液；分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中的SPE柱进行活化处理，再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱，然后用100-300μL水进行洗涤，最后加入40-100μL含有0.05-1mol/L盐酸的洗脱液，得到的液体即为待测样品； (四)待测样品的检测移取步骤(d)待测样品100μL，使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的去甲肾上腺素、肾上腺素和3-甲氧基酪胺色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图，将上述色谱图中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺峰面积及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的峰面积之比y1、y2和y3分别代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1＝ax1+b、y2＝cx2+d和y3＝ex3+f中，通过计算得到待检测样品中去甲变肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪胺浓度分别与标准内标液中对应的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比x1、x2和x3，标准内标液中去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度是已知的，通过计算得到待检测尿液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和-甲氧基酪胺浓度。 2.如权利要求1所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为：含有156.25ng/mL去甲变肾上腺素、含有125ng/mL变肾上腺素和含有156.25ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有312.5ng/mL去甲变肾上腺素、含有250ng/mL变肾上腺素和含有312.5ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有625ng/mL去甲变肾上腺素、含有500ng/mL变肾上腺素和含有625ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有1250ng/mL去甲变肾上腺素、含有1000ng/mL变肾上腺素和含有1250ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有2500ng/mL去甲变肾上腺素、含有2000ng/mL变肾上腺素和含有2500ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有5000ng/mL去甲变肾上腺素、含有4000ng/mL变肾上腺素和含有5000ng/mL的3-甲氧基酪胺；含有10000ng/mL去甲变肾上腺素、含有8000ng/mL变肾上腺素和含有10000ng/mL的3-甲氧基酪胺。 3.如权利要求2所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)中，所述替代基质是将4g牛血清白蛋白溶解在100mL生理盐水中，通过超声溶解制成，在步骤(a)和(b)中，所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液，所述溶解液是含有0.1mol/L盐酸的水溶液。 4.如权利要求3所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：在步骤(c)和(d)中，所述水解液是含有3mol/L盐酸的水溶液；所述中和液是含有3mol/L氢氧化钠的水溶液；所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵的水溶液。 5.如权利要求4所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96，SPE柱为Waters，WCXμElution Plate 30μm的萃取柱，萃取柱采用正压模式，气体是纯度为99.99％以上的氮气，萃取柱压力为1-15psi。 6.如权利要求5所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex，Kinetex F5，所使用的在线过滤器为1290 Infinity In-line Filter，分析色谱柱的柱温为40℃，进样量为1μL。 7.如权利要求6所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相为含有95:5比例的水：甲醇，分析色谱柱流速为0.25mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式。 8.如权利要求7所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集，定量离子对分别为去甲变肾上腺素166.1-134.2；变肾上腺素180.1-148.3；3-甲氧基酪胺151.1-119.1。 9.如权利要求8所述的检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法，其特征在于：所述浓度是指体积比的浓度，所述比例是指体积比的比例。
所属类别：	发明专利