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原文传递人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法

专利名称：	人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法
摘要：	本发明公开了一种人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：(1)样品预处理，尿液样品依次加入内标工作液和磷酸溶液，涡旋混合；(2)弱阳离子交换固相萃取96孔板(SPE96孔板)活化；(3)固相萃取处理，步骤(1)处理后样品上样至步骤(2)活化后的SPE 96孔板，甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液用氮气吹干；(4)复溶，高效液相色谱串联质谱法进行分析检测。本发明方法具有高准确度、高重现性、高灵敏度、高专属性、高效率、高通量、低成本、操作简便快速等优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司
发明人：	马金飞;冯加翼;康洲阳;刘华芬
专利状态：	有效
申请日期：	2018-12-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-03T00:00:00+0800
申请号：	CN201811648451.0
公开号：	CN109709255A
代理机构：	北京科家知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	陈娟
分类号：	G01N30/89(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	310013 浙江省杭州市余杭区仓前街道海创科技中心3幢1603-2室
主权项：	1.人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包含人尿液中游离去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)以及甲氧基肾上腺素(MN)的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤： (1)样本预处理：取100～500μL人尿液，依次加入10～50μL内标工作液和0.1～1mL磷酸溶液，涡旋混匀； (2)SPE96孔板活化：取弱阳离子交换固相萃取96孔板，依次加入1mL甲醇与水，待其自然流干； (3)固相萃取：将步骤(1)处理后的样品转移到步骤(2)活化后的SPE96孔板上，用氮气正压装置压干，依次加入0.1～1mL水与甲醇进行淋洗；再加入0.5～2mL 2％甲酸甲醇溶液洗脱，用96孔接收板收集洗脱液，通25～60℃氮气直至干燥； (4)将步骤(3)得到的残渣，进一步用50～200μL复溶液复溶，涡旋使充分溶解，上高效液相色谱串联质谱系统进样5～50μL分析检测。 2.根据权利要求1所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中内标工作液的配置方法如下：精密称取5种内标标准品，用0.5％焦亚硫酸钠溶液溶解得到1mg/mL的氘代去甲肾上腺素(NE-d6)、氘代肾上腺素(E-d3)、氘代多巴胺(DA-d4)、氘代甲氧基去甲肾上腺素(NMN-d3)以及氘代甲氧基肾上腺素(MN-d3)的内标储备液，然后用0.1％甲酸溶液进一步稀释混合得到NE-d6浓度为5μg/mL、E-d3浓度为500ng/mL、DA-d4浓度为200ng/mL、NMN-d3浓度为250ng/mL，MN-d3浓度为100ng/mL的内标工作液。 3.根据权利要求1所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中磷酸溶液质量比浓度为1～10％。 4.根据权利要求1所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中当检测项目包含甲氧基去甲肾上腺素(NMN)以及甲氧基肾上腺素(MN)时，步骤(1)还包括加入磷酸溶液后加热10～60分钟的操作。 5.根据权利要求1所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的复溶溶液为甲酸和醋酸铵溶液的混合物，其体积比为1:1000；其中醋酸铵溶液的浓度为5mmol/L。 6.根据权利要求1所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)所述的高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪。 7.根据权利要求1所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)采用的高效液相色谱串联质谱方法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：以水-乙腈-醋酸铵-甲酸为流动相体系，流动相的流速为0.4～1mL/min，柱温为30～45℃，采用多反应监测扫描模式(MRM)检测。 8.根据权利要求7所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液使用的流动相由以下流动相A和流动相B组成；其中流动相A相为体积分数0.1％甲酸-5mM醋酸铵溶液，流动相B相为体积分数0.1％甲酸-98％乙腈溶液，流动相A和流动相B的体积比为100～0：0～100％。 9.根据权利要求7所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述反相色谱法建立待测物的分离条件包括色谱柱的类型为C18柱、苯基柱或者改性苯基柱，填料粒径为1.7～5μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～150mm。 10.根据权利要求1或7所述的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(4)高效液相色谱串联质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)和MRM检测模式，用于检测去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)和甲氧基肾上腺素(MN)的母离子/子离子离子对如下所示：NE，m/z 169.9>m/z 152.1和m/z 169.9>m/z 107.2；E，m/z 184.0>m/z 107.2和m/z 184.0>m/z166.2；DA，m/z 154.1>m/z 91.1和m/z 154.1>m/z 137.1；NMN，m/z 166.0>m/z 134.1和m/z166.0>m/z149.3；MN，m/z 180.2>m/z 120.2和m/z 180.2>m/z 148.1；内标NE-d6的检测离子对为m/z176.2>m/z 158.1和m/z 176.2>m/z 111.3；E-d3的检测离子对为m/z 187.1>m/z 135.2；DA-d4的检测离子对为m/z 158.1>m/z 95.1和m/z 158.1>m/z 122.0；NMN-d3的检测离子对为m/z 169.0>m/z 137.2；MN-d3的检测离子对为m/z 183.1>m/z 123.2。
所属类别：	发明专利