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原文传递一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法

专利名称：	一种液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物的方法
摘要：	本发明属于临床生物样本检测技术领域，具体涉及血浆中儿茶酚胺及其代谢物检测技术，特别涉及高通量液相色谱串联质谱法检测儿茶酚胺及其代谢物(肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3‑甲氧基酪胺)的方法。所述方法包括：标准溶液配制、样本处理、样本检测以及计算公式。该方法可以同时检测儿茶酚胺及其代谢物共6种物质，具有高准确度、高灵敏度、高特异性以及所需样本体积少、样本前处理简单及耐受性好等优点。
专利类型：	发明专利
申请人：	中国医学科学院阜外医院
发明人：	周洲;倪伟;栗琳;王恺隽;赵丽平;武红梅;陆开智;肖冰心;潘媛媛;李彩霞;何启新
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T08:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010016762.6
公开号：	CN111175394A
分类号：	G01N30/02;G01N30/06;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/54;G01N30/60;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/54;G01N30/60
申请人地址：	100037 北京市西城区北礼士路167号
主权项：	1.一种使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪(LC-MS/MS)检测血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于，包括以下步骤： (一)标准溶液的配制 (a)标准曲线溶液配制：分析天平精确称取3-甲氧酪胺(3-MT)、变肾上腺素(MN)、去甲变肾上腺素(NMN)、多巴胺(DA)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)，各标准品分别含维生素C甲醇水溶液溶解，配制标准品储备液；使用甲醇水溶液稀释标准品储备液，配制混合标准曲线工作液；使其浓度范围分别为：3-甲氧酪胺3.9-1000pg/mL、变肾上腺素9.76-2500pg/mL、去甲变肾上腺素9.76-2500pg/mL、多巴胺19.5-5000pg/mL、肾上腺素19.5-5000pg/mL和去甲肾上腺素78-20000pg/mL； (b)内标溶液配制：分析天平精确称取3-甲氧酪胺-d4(3-MT-d4)、变肾上腺素-d3(MN-d3)、去甲变肾上腺素-d3(NMN-d3)、多巴胺-d4(DA-d4)、肾上腺素-d6(E-d6)、去甲肾上腺素-d3(NE-d3)，各内标分别用含维生素C甲醇水溶液溶解，配制内标储备液；使用甲醇水溶液稀释内标储备液，配制混合内标工作液；使其浓度分别为：2～10ng/mL 3-甲氧酪胺-d4、10～50ng/mL变肾上腺素-d3、10～50ng/mL去甲变肾上腺素-d3、10～50ng/mL多巴胺-d4、2～10ng/mL肾上腺素-d6和10～50ng/mL去甲肾上腺素-d3； (c)质控品配制：分析天平精确称取3-甲氧酪胺、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、多巴胺(DA)、肾上腺素、去甲肾上腺素，各标准品分别用含维生素C甲醇水溶液配制质控品储备液；使用水溶液稀释质控品储备液，分别配制低浓度、中浓度、高浓度，三个浓度混合质控品工作液；将10～20人份的血浆配制混合血浆，加入不超过混合血浆总体积10％的混合质控品工作液，混合均匀，得到低浓度质控品(LQC)、中浓度质控品(MQC)、高浓度质控品(HQC)；每支500μL分装于EP管中，储存于-80℃冰箱中备用； (二)血液的离心取待检血液至少4mL，在离心速度为3000rpm下离心15min，分离得到上清液血浆，置于-80℃保存备用； (三)待测血浆样本/标准曲线/质控品处理用移液枪移取内标工作液10～50μL于1.5mL离心管中，然后加入200～400μL待测血浆样本/标准曲线/质控品于上述离心管中，加入5-100μL含有50mmol/L乙酸铵的缓冲液，混合均匀；分别用200μL甲醇和水对固相萃取(SPE)柱进行活化处理，再分别将上述处理好的血浆、标准品和质控品全部转移至活化后的SPE柱；依次用200μL 5～40mmol/L乙酸铵溶液和200μL 10～50％乙腈异丙醇溶液洗涤，抽至近干后，用100μL 50～98％乙腈2％甲酸溶液洗脱，收集洗脱液，供高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测； (四)待测样本的检测使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测血浆样本/标准曲线/质控品进行检测；通过标准曲线的浓度及峰面积，拟合得到标准曲线方程，通过待测血浆样本的峰面积计算出待测血浆样本中的3-甲氧酪胺，变肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度。 2.根据权利要求1所述血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于：在步骤(a)、步骤(b)和步骤(c)中，所述配制标准品储备液中使用的抗氧化剂维生素C水溶液浓度是5～20mg/mL；所述配制标准品溶液使用的甲醇水溶液，其中甲醇含量为50～90％。 3.根据权利要求1所述血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于：在步骤(c)质控品配制中血浆加标浓度如下表。分析物 LQC pg/mL MQC pg/mL HQC pg/mL 3-MT 10～30 40～80 100～400 MN 20～80 100～300 400～800 NMN 50～200 200～600 800～1500 DA 20～100 100～400 500～1500 E 20～100 100～400 500～1500 NE 100～300 400～800 1000～3000 4.根据权利要求1所述血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于：(四)所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为XBridge Amide柱，填料粒径为1.7～5μm，内径2.1～4.6mm，柱长50～150mm；柱温为30～40℃，进样量为5～20μL。 5.根据权利要求1所述血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相A为含有0.5％甲酸水溶液和B为含有0.5％甲酸乙腈溶液，流速为0.4～0.6mL/min，分析色谱柱采用梯度洗脱方式，流动相A和流动相B的体积比为100～0％～0～100％。 6.根据权利要求1所述血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于：可以同时检测6个化合物(肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3-甲氧基酪胺)。 7.根据权利要求1所述血浆中儿茶酚胺及其代谢物含量的分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪检测采用电喷雾离子源(ESI)和多反映监测(MRM)扫描模式，具体的定量离子对与定性离子对如下。分析物定量离子对定性离子对 3-MT 151.1→91.1 151.1→119.0 MN 180.1→148.2 198.2→180.1 NMN 166.2→134.2 184.0→166.2 DA 154.0→91.0 154.0→137.0 E 184.2→135.0 184.2→107.0 NE 170.2→152.1 152.2→107.1
所属类别：	发明专利