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原文传递 检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法
专利名称: 检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法
摘要: 本发明检测血液中儿茶酚胺代谢物含量液质分析方法是用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对标准溶液进行标定,拟合得到标准曲线方程为y1=a*x1+b、y2=c*x2+d和y3=e*x3+f,在该待检测血液处理后,用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对待测的样品进行检测,得到待测血液y1、y2和y3值,将其代入标准曲线方程中,通过计算得到待测血液中儿茶酚胺三种物质的相对浓度x1、x2和x3,内标物工作液浓度是已知的,由此计算得到该样本中待检测血液中的儿茶酚胺代谢物浓度,本发明血浆经off‑line SPE处理后直接进样,使检测过程简便快速,检测灵敏度高,利于对患者体内儿茶酚胺含量进行测定。
专利类型: 发明专利
国家地区组织代码: 北京;11
申请人: 北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人: 刘春冉;翟瑞雪;贾永娟;倪君君
专利状态: 有效
申请日期: 2019-04-11T00:00:00+0800
发布日期: 2019-06-25T00:00:00+0800
申请号: CN201910287370.0
公开号: CN109932456A
代理机构: 北京双收知识产权代理有限公司
代理人: 解政文
分类号: G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址: 101111 北京市大兴区经济技术开发区经海六路5号东尚E园14号楼
主权项: 1.一种检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:它包括以下步骤: (一)、标准溶液的标定 (a)、标准工作液的配制: 精确称取去甲变肾上腺素标准品2.28mg置于2mL容量瓶中,用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度,得到标准储备液A,其去甲变肾上腺素的浓度为912.75μg/mL,用含有0.01%-1%甲酸稀释液从标准储备液A稀释得到标准中间液B,其去甲变肾上腺素的浓度为3μg/mL; 精确称取变肾上腺素标准品0.95mg置于10mL容量瓶中,用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度,得到标准储备液C,其变肾上腺素的浓度为78.53μg/mL,用含有0.01%-1%甲酸稀释液从标准储备液C稀释得到标准中间液D,其变肾上腺素的浓度为1.5μg/mL; 精确称取3-甲氧基酪胺标准品2.91mg置于10mL容量瓶中,用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度,得到标准储备液E,其3-甲氧基酪胺的浓度为230.86μg/mL,用含有0.01%-1%甲酸稀释液从标准储备液E稀释得到标准中间液F,其3-甲氧基酪胺的浓度为1.5μg/mL; 将标准中间液B、D和F以1:1:1的体积比混合后,用含有0.01%-1%甲酸稀释液进行稀释,在含有469-30000pg/mL去甲变肾上腺素、240-15000pg/mL变肾上腺素和240-15000pg/mL的3-甲氧基酪胺的浓度范围内配制出各浓度的标准工作液,并在-80℃条件下保存; (b)标准内标液的配制 取去甲变肾上腺素同位素内标储备液G,其去甲变肾上腺素内标浓度为100μg/mL,用含有0.01%-1%甲酸稀释液从标准储备液G稀释得到标准中间液H,其去甲变肾上腺素内标的浓度为100ng/mL; 取变肾上腺素同位素内标储备液I,其肾上腺素内标浓度为100μg/mL,用含有0.01%-1%甲酸稀释液从标准储备液I稀释得到标准中间液J,其变肾上腺素内标的浓度为100ng/mL; 精确称取3-甲氧基酪胺同位素内标标准品0.42mg于5mL容量瓶中,用含有0.05-0.5mol/L盐酸溶解液进行溶解并定容至刻度,得到内标储备液K,其3-甲氧基酪胺内标浓度为68.44μg/mL,用含有0.01%-1%甲酸稀释液从标准储备液K稀释得到标准中间液L,其3-甲氧基酪胺内标的浓度为100ng/mL; 将内标中间液H、J和K以2:2:1的体积比混合后,用含有0.01%-1%甲酸稀释液进行稀释,得到含有2ng/mL去甲变肾上腺素同位素、1ng/mL变肾上腺素同位素和2ng/mL的3-甲氧基酪胺同位素的标准内标液,并在-80℃条件下保存; (c)、用标准溶液标定,得到标准曲线方程: 用移液枪分别移取至少三种不同浓度的10μL标准工作液,将上述至少三种不同浓度的标准工作液分别与10μL标准内标液和290μL替代基质混合,并置于1.5mL离心管中混合制成至少三种标准溶液,上述替代基质为含有4%的牛血清白蛋白,在上述标准溶液中分别加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液,然后在转速1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后,分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中SPE柱进行活化处理,再将上述处理好的标准溶液分别全部转移至SPE柱,然后分别用100-300μL1:1的乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵的洗涤液进行洗涤,最后加入40-100μL含有2%甲酸和5-85%甲醇的洗脱液进行洗脱,分别取上述洗脱液100μL,用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述洗脱液进行检测,分别得出上述至少三种标准溶液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图,以上述至少三个标准溶液的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺峰面积与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y1、y2和y3,以上述标准工作液中含有去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素浓度之比作为标准曲线图的横坐标x1、x2和x3,将以上检测所得至少九组数据进行线性回归,拟合得到标准曲线方程为y1=a*x1+b、y2=c*x2+d和y3=e*x3+f,并且得出权重系数a、b、c、d、e和f; (二)检测血液的离心 取待检测血液至少5mL,在离心速度为3500rpm下离心10min,得到上清液即血浆,将上述血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用; (三)待测样品处理 (d)、用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10μL于1.5mL的离心管中,然后加入步骤(二)的300uL血浆于上述离心管中,再加入300μL含有20-100mmol/L乙酸铵的缓冲液,然后在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min;分别用100-300μL甲醇和水对off-line SPE固相萃取装置中SPE柱进行活化处理,再将上述离心管中的溶液全部转移至SPE柱,依次用100-300μL1:1乙腈与异丙醇和100-300μL含有5-40mmol/L乙酸铵的洗涤液进行洗涤,最后加入40-100μL含有2%甲酸和含有5-85%甲醇的洗脱液进行洗脱,得到的液体即为待测样品; (四)待测样品的检测 移取步骤(d)待测样品100μL,使用高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪对上述待测样品进行检测,得出上述待测样品的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺色谱图及其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的色谱图,将上述色谱图中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺的峰面积和其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素峰面积之比y1、y2和y3代入上述步骤(c)的标准曲线方程y1=a*x1+b、y2=c*x2+d和y3=e*x3+f中,通过计算得到待检测样品中去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺浓度与其对应的标准内标液中的去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度之比x1、x2和x3,标准内标液中去甲变肾上腺素同位素、变肾上腺素同位素和3-甲氧基酪胺同位素的浓度是已知的,通过计算得到待检测血液中的去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧基酪胺浓度。 2.如权利要求1所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:在步骤(c)中使用七种不同浓度的标准工作液,七种不同浓度的标准工作液分别为: 含有468.75pg/mL去甲变肾上腺素、含有234.4pg/mL变肾上腺素和含有234.4pg/mL3-甲氧基酪胺; 含有937.5pg/mL去甲变肾上腺素、含有468.75pg/mL变肾上腺素和含有468.75pg/mL3-甲氧基酪胺; 含有1875pg/mL去甲变肾上腺素、含有937.5pg/mL变肾上腺素和含有937.5pg/mL3-甲氧基酪胺; 含有3750pg/mL去甲变肾上腺素、含有1875pg/mL变肾上腺素和含有1875pg/mL3-甲氧基酪胺; 含有7500pg/mL去甲变肾上腺素、含有3750pg/mL变肾上腺素和含有3750pg/mL3-甲氧基酪胺; 含有15000pg/mL去甲变肾上腺素、含有7500pg/mL变肾上腺素和含有7500pg/mL3-甲氧基酪胺; 含有30000pg/mL去甲变肾上腺素、含有15000pg/mL变肾上腺素和含有15000pg/mL3-甲氧基酪胺。 3.如权利要求2所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:在步骤(c)中,所述替代基质是将4g牛血清白蛋白超声溶解在100mL生理盐水中,通过超声溶解制成的,在步骤(a)和(b),所述的溶解液是含有0.1mol/L盐酸的水溶液,所述的稀释液是由0.04:99.6的甲酸和水组成的稀释液。 4.如权利要求3所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:在步骤(c)和(d)中,所述缓冲液是含有50mmol/L乙酸铵水溶液,所述洗涤液是含有20mmol/L乙酸铵水溶液,所述的洗脱液是由2:5:93的甲酸:甲醇:水组成的洗脱液。 5.如权利要求4所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:所述off-line SPE固相萃取装置为Waters Positive Pressure-96,SPE柱为Waters,WCX μElution Plate 30μm的萃取柱,萃取柱采用正压模式,气体是纯度为99.99%以上的氮气,萃取柱压力为1-15psi。 6.如权利要求5所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪所使用的分析色谱柱为Phenomennex,KinetexF5,所使用的在线过滤器为1290 Infinity In-line Filter,分析色谱柱的柱温为40℃,进样量为20μL。 7.如权利要求6所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:所述分析色谱柱的流动相含有95:5比例的水和甲醇,分析色谱柱流速为0.3mL/min,分析色谱柱采用梯度洗脱方式。 8.如权利要求7所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:所述高效液相色谱三重四级杆串联质谱仪的采集方式为正离子采集,定量离子对分别为去甲变肾上腺素166.1-134.2;变肾上腺素180.1-148.3;3-甲氧基酪胺151.1-119.1。 9.如权利要求8所述的检测血液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法,其特征在于:所述浓度是指体积比的浓度,所述比例是指体积比的比例。
所属类别: 发明专利
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