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原文传递同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)方法

专利名称：	同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)方法
摘要：	本发明提供了一种同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，该方法包括：利用高效液相串联质谱仪，分别检测至少三种浓度具有内标物的维生素K1和维生素K2(MK4)混合标准溶液，拟合标准曲线方程；向具有已知浓度内标物的混合内标溶液中，添加待检测样品离心后的第一上清液和沉淀蛋白试剂，并添加萃取剂，混匀，高速离心，取第二上清液；通过氮吹方式，吹干第二上清液，复溶液溶解吹干后的剩余物，高速离心，取第三上清液；利用高效液相串联质谱仪，检测第三上清液；基于检测结果和标准曲线方程，得到待检测样品中维生素K1和维生素K2(MK4)的浓度。本发明提供的方案实现了同时检测维生素K1和维生素K2(MK4)。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京和合医学诊断技术股份有限公司
发明人：	许丽;雒琴;贾永娟;倪君君
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910630170.0
公开号：	CN110208437A
代理机构：	济南信达专利事务所有限公司
代理人：	李世喆
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	101111 北京市北京经济技术开发区经海六路5号院14号楼1层、2层、3层、5层、6层、7层
主权项：	1.同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，包括：利用高效液相串联质谱仪，分别检测至少三种浓度混合标准溶液，其中，所述混合标准溶液为具有内标物的维生素K1和维生素K2(MK4)混合标准溶液，且所述至少三种浓度混合标准溶液中内标物浓度一致；根据所述至少三种浓度混合标准溶液的检测结果，分别拟合维生素K1的标准曲线方程以及维生素K2(MK4)的标准曲线方程；向固定量的具有已知浓度内标物的混合内标溶液中，顺序添加待检测样品离心后的第一上清液和沉淀蛋白试剂，混合，并添加萃取剂，混合，高速离心，取第二上清液，其中，所述第一上清液的添加量为50～300μL；通过氮吹方式，吹干所述第二上清液，通过复溶液溶解吹干后的剩余物，混合，高速离心，取第三上清液；利用高效液相串联质谱仪，检测所述第三上清液；基于所述第三上清液的检测结果和维生素K1的标准曲线方程以及维生素K2(MK4)的标准曲线方程，得到所述待检测样品中维生素K1和维生素K2(MK4)的浓度。 2.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，所述高效液相串联质谱仪中，高效液相色谱的色谱条件包括：长度为50mm、内径为3.0mm以及填料粒径为2.7μm的C18色谱柱；洗脱流动相为含0.05％-0.25％甲酸的甲醇以及含0.05％-0.25％甲酸的乙腈；分析时长为4.0min；柱温为25-35℃；进样量为0.1-30μL；流速为0.50-1.00mL/min。 3.根据权利要求1或2所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，所述高效液相串联质谱仪中，串联质谱条件包括：采用大气压化学电离源APCI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，气帘气压力为20psi；碰撞气为5L/min；温度为300℃；雾化气压力为25psi；放电电流为1mA。 4.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，所述具有已知浓度内标物的混合内标溶液的固定量为10μL；和/或，所述沉淀蛋白试剂为乙醇，所述乙醇的用量为100～500μL；和/或，所述萃取试剂为正己烷，所述正己烷的用量为800～1200μL；和/或，所述复溶液为乙腈，所述乙腈的用量为50～200μL。 5.根据权利要求2所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，所述高效液相色谱采用梯度洗脱。 6.根据权利要求5所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，所述梯度洗脱，包括： 0.0～1.5min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇与含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的体积比为25：75；1.5～3.4min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇与含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的体积比为100：0；3.4～3.5min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇与含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的体积比为25：75。 7.根据权利要求1至6任一所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，所述维生素K1的标准曲线方程中的两个变量分别为：维生素K1的色谱峰面积与对应内标物的色谱峰面积的比值以及维生素K1浓度与对应内标物浓度的比值；所述维生素K2(MK4)的标准曲线方程中的两个变量分别为：维生素K2(MK4)的色谱峰面积与对应内标物的色谱峰面积的比值以及维生素K2(MK4)浓度与对应内标物浓度的比值。 8.根据权利要求1至6任一所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，进一步包括：制备标曲混合中间液：用85％～95％的甲醇水溶液稀释并混合维生素K1标准储备液和维生素K2(MK4)标准储备液，以得到含有0.5-10000ng/mL维生素K1、0.5-10000ng/mL维生素K2的系列标曲混合中间液，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月；制备混合内标工作液：用85％～95％的甲醇水溶液稀释并混合维生素K1内标物储备液和维生素K2(MK4)内标储备液，以得到含500ng/mL维生素K1内标物和500ng/mL维生素K2(MK4)内标物的混合内标工作液，并在-80℃避光保存，有效期为1年；制备混合标准溶液：分别移取10μL至少三种不同浓度标曲混合中间液，向移取的每一种浓度标曲混合中间液内加入10μL混合内标工作液和80μL乙腈，制成至少三种不同浓度的混合标准溶液。 9.根据权利要求8所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，所述利用高效液相串联质谱仪，分别检测至少三种浓度混合标准溶液，包括：将至少三种浓度混合标准溶液分别在转速为1500-2500rpm下涡旋混匀1-2min后，获取每一种浓度混合标准溶液对应的第四上清液，利用高效液相串联质谱仪检测每一种浓度混合标准溶液对应的第四上清液；和/或，该同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法进一步包括：制备维生素K1标准储备液：精确称取维生素K1标准品10mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，在-80℃条件下保存，有效期为6个月；制备维生素K2(MK4)标准储备液：精确称取维生素K2(MK4)标准品10mg置于10mL容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10mL，在-80℃条件下保存，有效期为6个月。 10.根据权利要求1至6，9中任一所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，所述至少三种浓度混合标准溶液，包括：浓度为0.5ng/mL维生素K1和0.5ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液、浓度为1ng/mL维生素K1和1ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液、浓度为2ng/mL维生素K1和2ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液、浓度为10ng/mL维生素K1和10ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液、浓度为50ng/mL维生素K1和50ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液、浓度为200ng/mL维生素K1和200ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液、浓度为1000ng/mL维生素K1和1000ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液、浓度为5000ng/mL维生素K1和5000ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液以及浓度为10000ng/mL维生素K1和10000ng/mL维生素K2(MK4)的混合标准溶液；和/或，所述内标物包括：维生素K1同位素以及维生素K2(MK4)同位素；和/或，所述混合为在1500-2500rpm转速下涡旋混合，其中，添加沉淀蛋白试剂后的混合时长控制在2～5min，添加萃取剂后的混合时长控制在3～10min，复溶液和吹干后的剩余物的混合时长控制在1～10min；和/或，高速离心的转速为10000-15000rpm，高速离心的时长为4-6min。
所属类别：	发明专利