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原文传递乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法

专利名称：	乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法
摘要：	本发明实施例提供的乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法，包括以下步骤：样品制备和对制备好的样品采用超高效液相色谱检测；其中：样品制备包括以下步骤：将乳样品用超纯水稀释、离心脱除乳脂肪和/或乳蛋白以获得游离低聚糖、对游离低聚糖进行荧光标记、上机检测前用超纯水将荧光标记低聚糖的浓度稀释至标准曲线范围之内。本发明的样品制备方法，对样本的需求量少(最低至10μL)，将先前报道的液相色谱‑荧光检测法的繁琐的样品制备方法简化，整个制备过程没有复杂的操作，仅需稀释和固定的离心操作，低聚糖衍生后不经过净化处理，减少了低聚糖的损失，大幅减少了人为随机误差的产生，提高了方法的易操作性、可靠性，提高了样品制备的通量。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京三元食品股份有限公司
发明人：	陈历俊;黄训文;杨春英;姜铁民;乔为仓;刘彦品;周伟明
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-23T00:00:00+0800
申请号：	CN201910530014.7
公开号：	CN110161147A
代理机构：	北京悦和知识产权代理有限公司
代理人：	田昕
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	100163 北京市大兴区瀛海镇瀛昌街8号
主权项：	1.乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：样品制备和对制备好的样品采用超高效液相色谱法、而非采用液质联用法进行定量分析；其中：样品制备包括以下步骤：将乳样品用超纯水调整至总碳水化合物浓度20mM以下、离心脱除乳脂肪和/或乳蛋白以获得游离低聚糖、对游离低聚糖进行荧光标记、上机检测前用超纯水将荧光标记低聚糖的浓度稀释至标准曲线范围之内。 2.根据权利要求1所述的高通量定量测定方法，其特征在于，样品包括液体样品或固体样品；所述液体样品包括母乳、牛乳或其它液体乳制品中的至少一种；所述固体样品包括全脂乳粉、脱脂乳粉或乳清粉中的至少一种。 3.根据权利要求1所述的高通量定量测定方法，其特征在于，可同时检测的乳中游离低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、4’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、6’-半乳糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、6’-唾液酸乳糖、乳-N-岩藻糖基五糖V、乳-N-岩藻糖基五糖I、乳-N-岩藻糖基五糖II、乳-N-二岩藻糖基六糖I、唾液酸乳-N-四糖c、二唾液酸乳糖中的至少两种；可选地，可同时检测的乳中游离低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、4’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、6’-半乳糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、6’-唾液酸乳糖、乳-N-岩藻糖基五糖V、乳-N-岩藻糖基五糖I、乳-N-岩藻糖基五糖II、乳-N-二岩藻糖基六糖I、唾液酸乳-N-四糖c和二唾液酸乳糖。 4.根据权利要求2所述的高通量定量测定方法，其特征在于，所述母乳中游离低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、4’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、6’-半乳糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、6’-唾液酸乳糖、乳-N-岩藻糖基五糖V、乳-N-岩藻糖基五糖I、乳-N-岩藻糖基五糖II、乳-N-二岩藻糖基六糖I、唾液酸乳-N-四糖c、二唾液酸乳糖中的至少一种。 5.根据权利要求2所述的高通量定量测定方法，其特征在于，所述牛乳、乳清粉、脱脂乳粉或全脂乳粉中游离低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、4’-半乳糖基乳糖、3’-半乳糖基乳糖、6’-半乳糖基乳糖、3’-唾液酸乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、6’-唾液酸乳糖、唾液酸乳-N-四糖c中的至少一种。 6.根据权利要求1所述的高通量定量测定方法，其特征在于，离心脱除乳脂肪和/或乳蛋白获得游离低聚糖包括采用以下2种离心方式中的任一种：超滤离心法或低温离心脱脂法；可选地，所述超滤离心法包括：将样品溶液转移至超滤离心管中，离心20～30min，超滤膜分子截留量3～10kDa，得到的透过液为游离低聚糖样品溶液；可选地，所述低温离心脱脂法包括：在4℃下6000～10000g离心10min，取下层清液作为游离低聚糖样品溶液。 7.根据权利要求1所述的高通量定量测定方法，其特征在于，对游离低聚糖进行荧光标记包括以下步骤：取分离得到的游离低聚糖样品溶液100微升，加入2-氨基苯甲酰胺(2-AB)溶液和2-甲基吡啶-N-甲硼烷溶液各50微升使得2-AB、2-甲基吡啶-N-甲硼烷相对于游离低聚糖过量，其中2-氨基苯甲酰胺(2-AB)溶液、2-甲基吡啶-N-甲硼烷溶液中使用的溶剂均为体积比85:15的二甲基亚砜和醋酸混合溶剂，涡旋混匀后，在65℃水浴中恒温孵育2.5h，取出冷却至室温，得到衍生后的游离低聚糖样品。 8.根据权利要求1所述的高通量定量测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱法中采用亲水作用色谱柱和/或荧光检测器；可选地，所述超高效液相色谱法的检测条件如下：检测器：荧光检测器；检测波长：激发波长250nm，发射波长425nm；色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH Amide色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm)；色谱柱温度：45～55℃；恒流速模式：0.400～0.500mL/min；进样量：1μL；流动相：pH4.5的甲酸铵溶液100mmol/L(A相)，乙腈(B相)；色谱分离流动相梯度条件；其中：N取值范围为63.0-64.5。 9.根据权利要求1所述的高通量定量测定方法，其特征在于，根据峰面积利用外标法建立的线性回归方程对低聚糖进行定量。 10.根据权利要求2所述的高通量定量测定方法，其特征在于， 1)将乳样品涡旋混匀后，用超纯水调整至总碳水化合物浓度20mM以下，将调整后的样品转移至超滤离心管中离心分离或在4℃下低温离心脱脂，得到游离低聚糖溶液； 2)用2-AB溶液和2-甲基吡啶-N-甲硼烷溶液对分离得到的游离低聚糖溶液中的游离低聚糖进行荧光标记，其中：2-氨基苯甲酰胺溶液和2-甲基吡啶-N-甲硼烷溶液中使用的溶剂为体积比85:15的二甲基亚砜和醋酸混合溶剂，再用超纯水将荧光标记低聚糖的浓度稀释至线性范围之内，然后用超高效液相色谱-荧光检测法检测，根据峰面积利用外标法建立的线性回归方程计算得到待测样品中游离低聚糖的含量。
所属类别：	发明专利