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原文传递利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法

专利名称：	利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法
摘要：	本发明公开了一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，利用了DNA与RNA碱基互补配对原则，首先，设计了具有发夹结构的功能探针，当目标物（待测样品microRNA）存在时，特异性核酸内切酶（DSN酶）切割DNA‑RNA杂交体的DNA部分得到8‑17DNAzyme。然后，8‑17DNAzyme能特异性识别固定在电极表面的H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点进行切割。最后，电极表面被DNAzyme特异性切割后与电极表面相连的DNA序列依次与序列Link1、Link2、H3和H4自组装形成电化学生物传感器用于目标检测。所建立的方法灵敏度高，可用于复杂体系的microRNA的直接检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	福建;35
申请人：	福州大学
发明人：	陈宪;李璟
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-24T00:00:00+0800
申请号：	CN201910647121.8
公开号：	CN110274941A
代理机构：	福州元创专利商标代理有限公司
代理人：	饶文君;蔡学俊
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	350108 福建省福州市闽侯县上街镇福州大学城学院路2号福州大学新区
主权项：	1.一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8-17DNAzyme序列的双功能探针H1；双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分， H1探针被切割得到游离的8-17DNAzyme序列，而microRNA被释放出来继续与未反应H1探针杂交循环切割，实现第一次目标循环；然后将发夹探针H2固定在金电极上；当金属离子存在时，前述8-17DNAzyme会特异性识别H2 序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割，H2探针被切断成两部分，一部分与电极相连，一部分为游离的碱基序列，同时释放8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大；电极表面的H2被DNAzyme切断后，依然有部分碱基序列固定在电极表面上，这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装，形成一条dsDNA链；最后，六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上，通过检测六氨合钌的电化学信号，实现对microRNA的超灵敏检测。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）针对目标microRNA设计双功能探针H1，所述探针为发夹结构的DNA探针；设计固定在电极表面的探针H2，该发夹探针5'端修饰巯基；（2）双特异性核酸内切酶（DSN酶）特异性切割：将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min；使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分，得到8-17DNAzyme序列，并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割，实现目标循环放大；其中DSN缓冲液包含：0.2U DSN，50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1 mM DTT，pH 8.0；（3）电极预处理：将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液浸泡，然后依次用0.3μm和0.05 μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨，然后用超纯水冲洗干净，分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中，在-0.35-1.6V电位下扫描，直到在0.95V出现一个尖锐的还原峰，在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰，用超纯水冲洗电极，氮气吹干，备用；食人鱼溶液为98％硫酸和30％双氧水按3：1的体积混合；（4）捕获探针H2的固定：在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP、pH 8.0的10mMTris-HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液，得到捕获探针H2固定液；将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面，室温孵育120min，H2可通过S-Au键固定在电极表面，再用10mMpH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；（5）电极表面空白位点封闭：将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤（4）所得电极表面，室温孵育120min，封闭电极表面的非特异性活性位点，用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；（6）8-17DNAzyme的切割循环：将步骤（2）微量离心管中的溶液滴加于步骤（5）处理好的电极表面，孵育90min，用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，氮气吹干；（7）DNA自组装电化学生物传感器的构建：将步骤（6）得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后，依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液，10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液，10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液，分别反应90min、90min和120min，超纯水冲洗，氮气吹干；（8）电化学检测microRNA信号：将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气，再将步骤（7）所得电极置于电化学检测液中，电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描检测。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针H1序列为：CACCCACTACCCATCTTTACCAGACAGTGTTACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTG；所述探针H2为：SHCH2CH2CH2CH2CH2CH2TTTTTCCACCACATTCAAATTCACCAACTATrAGGAAGAGATGTTACGAGGCGGTGGTGG；所述Link1序列为：CCA ACTAAC CCCATATAGTTGGTGAAT；所述Link2序列为：ATGGGGTTAGTT GGATCGCCT CATACTGTCTCAAGG ACCACCGCAT；所述H3序列为：TCTCAAGGACCACCGCAT CTCTAC ATGCGGTGGTCCTTGAGA CAGTATGAG GCGA；所述H4序列为：GTAGAG ATGCGGTGGTCCTTGAGA TCGCCT CATACTG TCTCAAGGACCACCGCAT。 4.如权利要求1或2所述方法制备获得电化学生物传感器。 5.如权利要求4所述电化学生物传感器用于microRNA的检测。
所属类别：	发明专利