详情

原文传递一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法

专利名称：	一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法
摘要：	本发明属于细胞检测技术领域，涉及一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法。本发明采用已被核酸适配体功能化的DNA四面体纳米结构探针(Apt‑DTNs)与癌细胞特异性结合，分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt‑DTNs探针后，溶液中剩余的Apt‑DTNs探针浓度发生变化；加入电活性物质后，由于电活性物质嵌入到Apt‑DTNs中，从而导致游离的电活性物质浓度发生变化，通过电化学检测获得信号值，经数据处理后获得癌细胞的存在情况和存在数量。本发明的基于Apt‑DTNs的免标记均相电化学传感方法，在不固定任何生物识别分子的前提下，可直接检测电活性分子的电流信号，无需标记DNA，具有成本低、操作简单等优点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	青岛农业大学
发明人：	杨立敏;李峰;尹雪晗
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-17T00:00:00+0800
申请号：	CN201910667148.3
公开号：	CN110243891A
代理机构：	青岛发思特专利商标代理有限公司
代理人：	巩同海
分类号：	G01N27/26(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	266109 山东省青岛市城阳区长城路700号
主权项：	1.一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，采用已被核酸适配体功能化的DNA四面体纳米结构探针，命名为Apt-DTNs探针，与癌细胞特异性结合，分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt-DTNs探针后，溶液中剩余的Apt-DTNs探针浓度发生变化；加入电活性物质后，由于电活性物质嵌入到Apt-DTNs中，从而导致游离的电活性物质浓度发生变化，通过电化学检测获得信号值，经数据处理后获得癌细胞的存在情况和存在数量。 2.根据权利要求1所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述Apt-DTNs探针包括DNA四面体骨架以及可与靶蛋白识别并结合的核酸适配体序列，核酸适配体序列位于DNA四面体骨架的顶角；所述DNA四面体骨架由四条相互互补的核酸双链及未配对的单碱基构成。 3.根据权利要求2所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述DNA四面体骨架由四条单链DNA进行互补配对组装而成，DNA四面体骨架每条边均由17对脱氧核糖核苷酸通过碱基互补配对形成，核酸适配体序列通过若干重复排列的脱氧核糖核苷酸与单链DNA相连。 4.根据权利要求1所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述核酸适配体序列为与癌细胞表面过表达的蛋白质发生特异性识别并结合的一段核酸序列。 5.根据权利要求2-4任一项所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述Apt-DTNs探针的制备方法，将含有核酸适配体序列的单链DNA加入单链自组装的离子缓冲液中，然后进行退火处理，使其自组装形成DNA四面体纳米结构探针。 6.根据权利要求5所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述单链DNA序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，核酸适配体序列如SEQ ID NO.5所示。 7.根据权利要求5或6所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，将四条等摩尔量的单链DNA，其中一条或两条以上5’端连接有核酸适配体序列，溶解在TM缓冲溶液中，加热至95℃，反应3-10分钟，然后在冰浴中快速冷却5-10分钟后得到DNA四面体纳米结构探针；其中TM缓冲溶液中含有20mM Tris，50mM MgCl2，溶液pH＝8.0。 8.根据权利要求7所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)不引入目标癌细胞，将电活性物质加入到含有Apt-DTNs探针的缓冲溶液中，进行电化学测量； (2)引入目标癌细胞，将目标癌细胞加入到与步骤(1)中缓冲溶液所含等量Apt-DTNs探针的缓冲溶液中，孵育一段时间，离心分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt-DTNs探针后，获得上清液，上清液中含有未与癌细胞结合的Apt-DTNs探针； (3)将电活性物质加入到步骤(2)获得的上清液中，进行电化学测量，根据测量结果与标准曲线计算癌细胞数量。 9.根据权利要求8所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述电活性物质为亚甲基蓝；利用三电极法进行电化学测量，三电极包括氧化铟锡导电玻璃电极(ITO)、Ag/AgCl电极和铂丝，依次分别为工作电极、参比电极和对电极；所述电化学测量选择差分脉冲伏安法，扫描电压范围是-0.4 V至0V。 10.根据权利要求1所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述方法在制备和/或检测待测样本中含有高表达粘蛋白的癌细胞的产品中的应用，所述待测样本为外周血或细胞培养。
所属类别：	发明专利