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原文传递一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法及其应用

专利名称：	一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法及其应用
摘要：	本发明涉及一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法及其应用，所述生物标志物检测方法为：采用包被抗体和标记抗体分别对两种不同粒径的金纳米微球进行功能化处理，然后与待检测的生物标志物发生特异性结合，使两种不同粒径的金纳米微球发生等离子共振，得到具有等离子共振散射效应的免疫纳米阵列芯片，从而实现对生物标志物的定量检测。该方法用到的金纳米颗粒的等离子共振信号稳定，采集单颗粒信号检测灵敏度高，分析速度快，简单、重复性强，并且由统计得到的检测数据更为可靠；该方法不仅可以应用于免疫检测方面，在医学、环境保护以及食品安全检测方面同样适用，适用范围很广。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	华东理工大学
发明人：	马巍;李大伟;韩焕兴;郭丹;许多;于汝佳
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910522057.0
公开号：	CN110231473A
代理机构：	北京品源专利代理有限公司
代理人：	巩克栋
分类号：	G01N33/53(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	200237 上海市徐汇区梅陇路130号
主权项：	1.一种基于金纳米微球等离子共振的生物标志物检测方法，其特征在于，所述生物标志物检测方法为：采用包被抗体和标记抗体分别对两种不同粒径的金纳米微球进行功能化处理，然后与待检测的生物标志物发生特异性结合，使两种不同粒径的金纳米微球发生等离子共振，得到具有等离子共振散射效应的免疫纳米阵列芯片，从而实现对生物标志物的定量检测。 2.如权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述生物标志物检测方法包括如下步骤： (1)制备粒径不同的第一金纳米微球和第二金纳米微球； (2)分别在步骤(1)得到的第一金纳米微球和第二金纳米微球上修饰鼠抗单抗标记抗体和鼠抗单抗包被抗体，得到修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球； (3)对步骤(2)得到的修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球进行封闭； (4)将步骤(3)得到的封闭好的修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球混合，再与待测生物标志物共孵育，得到具有三明治免疫夹心结构的金纳米微球混合溶液； (5)获取步骤(4)中金纳米微球混合溶液的散射光谱位移信息，根据待测生物标志物标准品建立的标准曲线计算得到待测生物标志物的含量。 3.如权利要求2所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(1)所述第一金纳米微球的粒径为5-30nm；优选地，所述第二金纳米微球的粒径为40-100nm；优选地，所述第一金纳米微球的制备方法为柠檬酸三钠还原法；优选地，所述第一金纳米微球的制备方法为：将1-2％的四氯金酸溶液与超纯水混合，加热至沸腾后加入1-2％的柠檬酸三钠溶液，继续加热保持沸腾至溶液颜色无变化，再加热10-20min，得到所述第一金纳米微球的溶液；优选地，所述超纯水与四氯金酸溶液的体积比为(50-500):1；优选地，所述超纯水与柠檬酸三钠溶液的体积比为(3-15):1。 4.如权利要求2或3所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(1)所述第二金纳米微球的制备方法为种子生长法；优选地，所述第二金纳米微球的制备方法为：在第一金纳米微球的溶液中加入0.1-0.3M盐酸羟胺和超纯水，再在搅拌状态下加入0.01％-0.03％的氯金酸溶液，得到所述第二金纳米微球的溶液；优选地，所述第一金纳米微球溶液与盐酸羟胺的体积比为(8-12):1；优选地，所述第一金纳米微球溶液与超纯水的体积比为1:(10-15)；优选地，所述第一金纳米微球溶液与氯金酸溶液的体积比为1:(1-5)。 5.如权利要求2-4中任一项所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(2)所述在第一金纳米微球上修饰标记抗体的方法为：将第一金纳米微球与标记抗体混合并反应，得到所述修饰有抗体的第一金纳米微球；优选地，所述第一金纳米微球与标记抗体的质量比为1.28×10-7:(1.5×10-4-1.5×10-2)；优选地，所述反应的时间为10-14h；优选地，所述反应的温度为20-30℃；优选地，步骤(2)所述在第二金纳米微球上修饰包被抗体的方法为：将第二金纳米微球与包被抗体混合并反应，得到所述修饰有抗体的第二金纳米微球；优选地，所述第二金纳米微球与包被抗体的质量比为1.28×10-8:(2.5×10-4-1×10-3)；优选地，所述反应的时间为10-14h；优选地，所述反应的温度为20-30℃。 6.如权利要求2-5中任一项所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(3)所述对修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球进行封闭的试剂为牛血清白蛋白溶液；优选地，所述牛血清白蛋白溶液的质量浓度为0.1-1％；优选地，所述封闭的时间为10-14h；优选地，所述封闭完成后对第一金纳米微球和第二金纳米微球分别离心并重新分散于牛血清白蛋白溶液中；优选地，所述对第一金纳米微球的离心速度为9000-12000rpm/min；优选地，所述对第二金纳米微球的离心速度为4000-6500rpm/min；优选地，所述离心的时间为3-10min。 7.如权利要求2-6中任一项所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(4)所述混合时第一金纳米微球和第二金纳米微球的质量比为(3-7):1；优选地，所述待测生物标志物与第一金纳米微球的质量为(10-10-10-4):1.28×10-7；优选地，所述共孵育的时间为0.5-2h；优选地，所述共孵育的温度为35-40℃。 8.如权利要求2-7中任一项所述的生物标志物检测方法，其特征在于，步骤(5)所述获取金纳米微球混合溶液的散射光谱位移信息的具体方法为：将ITO导电玻璃片放入金纳米微球混合溶液中浸泡1-3min后，洗净并氮气吹干，置于倒置暗场显微镜下统计得到待测生物标志物的散射光谱位移；优选地，所述待测生物标志物标准品的标准曲线是通过如下方法建立的：选取4-10个不同浓度的待测生物标志物标准品溶液，按照权利要求2所述步骤对各标准品的散射光谱位移进行测定，以待测生物标志物标准品与空白对照品的散射光谱位移差为纵坐标，以待测生物标志物标准品的浓度对数值为横坐标，建立标准曲线，求出标准曲线的方程；其中空白对照品是指与待测生物标志物标准品等体积的PBS缓冲液。 9.如权利要求2-8中任一项所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述生物标志物检测方法包括如下步骤： (1)采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为5-30nm的第一金纳米微球，采用种子生长法制备粒径为40-100nm的第二金纳米微球； (2)将第一金纳米微球与标记抗体以质量比为1.28×10-7:(1.5×10-4-1.5×10-2)混合并在20-30℃下反应10-14h，得到所述修饰有抗体的第一金纳米微球；将第二金纳米微球与包被抗体以质量比为1.28×10-8:(2.5×10-4-1×10-3)混合并在20-30℃下反应10-14h，得到所述修饰有抗体的第二金纳米微球； (3)对步骤(2)得到的修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球用质量浓度为0.1-1％的牛血清白蛋白溶液进行封闭10-14h，封闭完成后对第一金纳米微球和第二金纳米微球分别以9000-12000rpm/min和4000-6500rpm/min离心3-10min并重新分散于牛血清白蛋白溶液中； (4)将步骤(3)得到的封闭好的修饰有抗体的第一金纳米微球和第二金纳米微球以质量比为(3-7):1混合，再与待测生物标志物在35-40℃下共孵育0.5-2h，得到具有三明治免疫夹心结构的金纳米微球混合溶液； (5)将ITO导电玻璃片放入步骤(4)中金纳米微球混合溶液中浸泡1-3min后，洗净并氮气吹干，置于倒置暗场显微镜下统计得到待测生物标志物的散射光谱位移；根据待测生物标志物标准品建立的标准曲线计算得到待测生物标志物的含量。 10.如权利要求1-9中任一项所述的生物标志物检测方法在检测生物标志物中的应用。
所属类别：	发明专利