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原文传递一种基于三螺旋分子开关超灵敏测定LPS双放大ECL生物传感器及其应用

专利名称：	一种基于三螺旋分子开关超灵敏测定LPS双放大ECL生物传感器及其应用
摘要：	本发明公开了一种基于三螺旋分子开关超灵敏测定LPS的新型双放大生物传感器及其制法和应用。本发明的技术方案是：通过目标和适配体的特定识别，释放的DNA与多功能分子信标(PMB)杂交，通过Klenow片段和Nt.BbvCI切口酶产生大量片段。将大量片段引入CdTe‑Ru@SiO2纳米球/TPrA‑ECL‑三螺旋传感系统，打开三螺旋结构，通过氯化血红素有效淬灭ECL产生响应，实现三螺旋分子“开‑关”信号响应模式检测目标LPS。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	青岛科技大学
发明人：	接贵芬;接贵霞
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-24T00:00:00+0800
申请号：	CN201910624183.7
公开号：	CN110274948A
代理机构：	青岛中天汇智知识产权代理有限公司
代理人：	刘晓
分类号：	G01N27/48(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	266000 山东省青岛市市北区郑州路53号
主权项：	1.一种基于三螺旋分子开关超灵敏测定LPS的新型双放大生物传感器及其制法和应用。其特征是：通过目标和适配体的特定识别，磁性分离释放的DNA与多功能分子信标(PMB)杂交,利用聚合酶和内切酶放大反应过程产生大量的DNA片段。该片段引入三螺旋传感系统,打开三螺旋结构并利用氯化血红素淬灭ECL产生响应，实现对目标的检测。该多功能生物传感器具有良好的分析性能，较宽的线性范围和较低的检测极限。 2.一种制备权利要求1所述的基于三螺旋分子开关超灵敏测定LPS的新型双放大生物传感器的方法和应用，其特征方法由下列步骤组成：步骤1.CdTe-Ru@SiO2纳米球的制备采用两步法制备水溶性CdTe QDs。根据Gu等人公布的方法制备碲化氢钠(NaHTe)。在氮气环境中，将50.0mg NaBH4和80.0mgTe粉末在45℃下加入3.0mL超纯水中30分钟。在Te粉末完全消失后，此时溶液变为深紫色，得到透明的NaHTe溶液。将2.5mmol的CdCl2溶解于63mL的超纯水中，然后加入5μL的MPA，用氮气脱气，用0.2mol L-1NaOH将pH调节至9.0。然后将250μL NaHTe溶液快速注入CdCl2反应烧瓶中，加热至130℃并在氮气环境下回流12小时。冷却至室温后，得到橙红色CdTe QDs溶液。制备的CdTe QD(200μL)与[Ru(bpy)3]2+(80mM,170μL)在锥形瓶中反应过夜。然后环己烷，TX-100在恒定搅拌下和正己醇注入混合物中25分钟。快速注入前体TEOS(100μL)后，加入60μLNH3·H2O以引发聚合反应。在密封容器中避光反应24小时后，用丙酮分离所得产物，离心(12000rpm，10分钟)用乙醇纯化。将获得的CdTe-Ru@SiO2纳米球分散在PBS溶液中。步骤2.适配器改性磁珠的制备首先分离100μL羧基修饰的磁珠(粒径：2.0～3.0μm；量：10mL，1％(w/v))用0.5mL PBS缓冲液(pH7.4,0.1M Na2HPO4·12H2O,0.1M NaH2PO4·2H2O,0.1M KCl)洗涤三次。然后将磁珠在含有10mg NHS和20mg EDC的200μL的0.1M PBS缓冲液中活化1小时，同时在室温下轻轻摇动，弃去上清液。将100μL 1.0μM氨基修饰的LPS适体加入到活化的磁珠溶液中，并使得到的混合物在37℃下在恒温振荡器中反应6小时。磁力分离并用200μL PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)洗涤三次后，37℃下将适体-磁珠分散在200μL 0.1M PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)中1小时。接着，将300μL的三种mDNA(每个10-5M)在37℃下加入上述溶液中2小时。用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)洗涤三次后，将杂交复合物重悬于200μL PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)中以备进一步使用。将最终的适体-mDNA-磁珠溶液储存在4℃的冰箱中。步骤3目标循环扩增反应在10μL的悬浮液中加入一定浓度的15μL LPS。然后,在37℃孵育2小时,释放m1,m2,m3。磁分离后,m1、m2和m3被留在上清液中。然后2.5μL 10×NE缓冲液2(氯化钠500mM,100mMTris-HCl,100mM MgCl2,10mM二硫苏糖醇(DTT)，pH值7.925℃),0.5μL μM PMB的0.1，0.6μL5U/μL大片段(3′－5′exo-)，0.6μL 10U/μL Nt.BbvCI nickase,1μL的10mM核苷酸，20μL上层清液都先后加入小管。轻轻混合后,在37℃孵育90分钟。随后,反应在80℃下热失活，终止20分钟,溶液冷却到室温。产生大量的NFs片段。步骤4三重螺旋DNA的构建在45μL孵化器中加入了DNA S1(50μL,1.0μM)和DNA S2(50μL,1.0μM)(10mM PB,20mMNaCl,2.5mM MgCl2,pH 5.2),并在室温下孵育2小时,形成三螺旋DNA。 3.根据权利要求2所述的LPS检测方法，其特征是：分别用1.0、0.3、0.05μm氧化铝粉末抛光金电极，用超纯水冲洗。将电极置于50％甲醇溶液中超声处理3min；接下来，电极在0.5M H2SO4中进行电化学清洗，电位扫描从-0.3V到1.5V，直到得到可重复的循环伏安图，超纯水冲洗，氮气干燥。随后将10μL CdTe-Ru@SiO2纳米球溶液滴于裸露的金电极表面，在空气中干燥。然后将电极浸入EDC/NHS(20mg·mL-1/10mg·mL-1)溶液中20min活化羧基，用超纯水冲洗。将电极浸泡在三螺旋DNA溶液中6小时，超纯水冲洗。将电极浸泡在NFs中2小时，超纯水冲洗。最后,10μL氯高铁血红素(7*10-4M)是用移液器吸取到30分钟的修饰电极，形成氯化铁血红素/G-四链体纳米结构。用超纯水冲洗改性电极，并在空气中干燥。ECL检测在含10mm TPrA的PBS缓冲液(0.1M,pH＝7.4)中进行。扫描电位为0.2～1.25V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管为-500V。
所属类别：	发明专利