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原文传递一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法

专利名称：	一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法
摘要：	本专利公开了一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，在电极表面修饰半导体ZnO纳米材料及不同粒径CdTe量子点形成级联结构，极大的增强了光电流强度。通过三螺旋分子的形成和拆解，三螺旋分子开关的优越性为核酸的高特异性检测开辟了新的策略，借助电化学工作站实现了对核酸的超灵敏检测。本发明通过改变适配DNA的序列，发明的光致电化学传感器还可以用于各种核酸的检测，该方法具有低成本、高灵敏、响应快速的优点，在生物分析和临床诊断中具有重要的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	葛慎光;王绍鹏;赵金歌;李娜;王芳芳;付翠萍;于京华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-15T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201910300737.8
公开号：	CN109959691A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	李茜
分类号：	G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号
主权项：	1.一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征包括以下步骤：（1）设计纸芯片工作层和辅助层的亲水区域和疏水蜡打印区域，在纸芯片工作层亲水区域制备生长金纳米粒子的工作电极，辅助层亲水区域制备参比电极和对电极；（2）将 ZnO 纳米棒（ZnO NRs）和两种不同粒径的 CdTe-COOH 量子点（CdTe-COOH QDs）和 CdTe-NH2 量子点（CdTe-NH2 QDs）形成级联光电活性材料固定在步骤（1）所得工作电极制备光致电传感界面；（3）将发夹结构的 DNA (H-DNA) 固定在步骤（2）所得光致电传感界面，随后采用6-巯基己醇（MCH）封闭非特异性活性位点；（4）将标记碱性磷酸酶和适配 DNA 修饰的金纳米粒子（ALP-Au NPs-DNA）固定在步骤（3）所得光致电传感界面制备光致电化学传感器；（5）将目标 DNA （T-DNA）滴加到步骤（4）所得光致电化学传感器，利用500W氙灯光源激发，电化学工作站检测产生的光电流。 2.根据权利要求书1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的纸材料为色谱纸，纸芯片图案用 Adobe IllustratorCS4 软件设计，该微流控纸芯片包括工作层和辅助层，工作层和辅助层中间圆形区域为亲水区域，其余部分为蜡打印疏水区域，其中工作层亲水区域直径尺寸为6 mm，辅助层亲水区域直径尺寸为8 mm；采用丝网印刷的方法，在工作层亲水区域印刷碳工作电极，辅助层亲水区域印刷Ag/AgCl参比电极和碳对电极；本发明所述在纸芯片工作层亲水区域制备生长金纳米粒子的工作电极的步骤为：首先将80 mL 蒸馏水加热至90 ℃，然后加入0.8 mL 质量分数为 1% 的氯金酸溶液继续加热至96 ℃ 保持1分钟，最后加入2.8 mL 质量分数为 1% 的柠檬酸钠，加热8分钟得到金种子溶液，取20 μL 金种子溶液滴加在工作层亲水区域，静置晾干，重复三次，制备得到生长金纳米粒子的工作电极。 3.根据权利要求书1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，将 ZnO NRs 和两种不同粒径的 CdTe-COOH QDs 和 CdTe-NH2 QDs 相继固定在步骤（1）所得的工作电极的步骤为： ZnO NRs 的制备步骤如下：在搅拌下将0.44 g 醋酸锌溶解在10 mL 乙醇胺中以形成透明溶液，向溶液中加入5 mL 水和15 mL 乙二醇并超声处理30分钟，随后将溶液转移到100 mL 聚四氟乙烯内衬的高压釜中在180 ℃ 加热4小时，反应后将其在室温下自然冷却至室温，将沉淀物离心并用无水乙醇和蒸馏水分别冲洗3次，在室温下干燥12小时得到 ZnO粉末； CdTe-COOH QDs 的制备步骤如下：将89 μL 3-巯基丙酸加入到配有冷凝器和温度计的三颈烧瓶中的120 mL 5mM CdCl2 水溶液中，之后将溶液用氮气鼓泡持续30分钟，在搅拌下滴加1.0 M NaOH 溶液调节pH至11.8，然后将0.12 g 硼氢化钠和0.0133 g 亚碲酸钠相继注入溶液中，反应在100 ℃ 和氮气气氛中进行6小时，得到 CdTe-COOH QDs 溶液； CdTe-NH2 QDs 的制备步骤如下：在搅拌下将3.6 mmol 的巯基乙胺加入到圆底烧瓶中的100 mL 12 mM CdCl2 水溶液中，将溶液用高纯度氮气脱气30分钟，然后加入稀 NaOH 溶液将溶液的pH调节至5.7，然后将0.1 g 硼氢化钠和0.0133 g 亚碲酸钠相继注入溶液中，将反应混合物溶液加热至100 ℃ 并在氮气气氛下回流1小时，最后获得 CdTe-NH2 QDs 溶液；将 ZnO NRs 溶解在0.1 mM 4-氨基苯硫酚（PATP）乙醇溶液中，将混合物搅拌4小时，然后将沉淀物离心并溶解在乙醇溶液中，得到 ZnO/PATP，滴加10~200 μL ZnO/PATP 溶液于生长金纳米粒子的工作电极上，室温下静置20分钟，待其干燥后，逐次滴加20 μL CdTe-COOH QDs 和20 μL CdTe-NH2 QDs，室温下孵育30分钟，最后，使用超纯水洗涤上述工作电极3次，于室温下干燥30分钟，制备得到 CdTe-NH2/CdTe-COOH/ZnO NRs 级联光电活性材料修饰的光致电传感界面。 4.根据权利要求书1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，将 H-DNA 固定在步骤（2）所得的光致电传感界面，随后采用MCH封闭非特异性活性位点的步骤为：将20 μL 20 mg/mL N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和10 mg/mL羟基丁二酰亚胺的混合溶液滴加到步骤（2）所得的光致电传感界面并孵育30分钟，然后滴加20 μL 1μM 的 H-DNA，孵育16小时，加入20 μL MCH 放置30分钟封闭光致电传感界面的非特异性活性位点。 5.根据权利要求书1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，将 ALP-Au NPs-DNA 固定在步骤（3）所得光致电传感界面的步骤为：在2.0mL Au NPs 溶液中滴加0.2 M K2CO3溶液将pH调节至8.2，然后将20 μL 1 μM DNA 和40 μL0.8 mg/mL碱性磷酸酶加入其中，孵育2小时，将混合物以10000 rpm离心20分钟，并用磷酸洗涤缓冲液洗涤三次，将沉淀物分散在200 μL 蒸馏水中以获得 ALP-Au NPs-DNA 分散液；取20 μL ALP-Au NPs-DNA 滴加到光致电传感界面，在室温下孵育90分钟，制备得到光致电化学传感器。 6.根据权利要求书1所述一种基于级联光电活性材料和三螺旋分子开关检测核酸的方法，其特征在于，将 T-DNA 滴加到步骤（4）检测光电流的步骤为：将20 μL T-DNA 滴加到步骤（4）所得的光致电化学传感器的工作区域，利用500W氙灯产生的白光作为光源激发，在含有0.1 M 抗坏血酸磷酸钠的磷酸盐缓冲溶液中利用电化学工作站进行光电流检测。
所属类别：	发明专利