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一种基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法
| 专利名称： | 一种基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法 |
| 摘要： | 本发明属于核酸分子检测技术领域，公开了一种基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，采用3D纳米步行机对miRNA141识别及剪切扩增，结合磁珠与剪切酶循环技术释放银纳米粒子，通过酸将纳米粒子转换为离子，与光电材料CdSe进行阳离子交换，使CdSe光电信号降低，实现对miRNA141的检测。本发明具有光电化学活性的物质在光作用下，外层电子吸收能量产生跃迁从而传递电荷，电极材料经过修饰；可以同DNA，抗体，纳米金等物质相结合，极大的丰富了光致电化学传感器的应用范围，并且还可以同PCR，酶联反应，循环扩增等方法结合，提高检测的灵敏度。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 山东;37 |
| 申请人： | 青岛科技大学 |
| 发明人： | 宋维玲;张忠慧;张峰;何鹏 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 2019-07-04T00:00:00+0800 |
| 发布日期： | 2019-10-11T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201910598075.7 |
| 公开号： | CN110320258A |
| 代理机构： | 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) |
| 代理人： | 汤东凤 |
| 分类号： | G01N27/327(2006.01);G;G01;G01N;G01N27 |
| 申请人地址： | 266042 山东省青岛市市北区郑州路53号青岛科技大学化学与分子工程学院 |
| 主权项： | 1.一种基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法采用3D纳米步行机miRNA141识别及剪切扩增，结合磁珠与剪切酶循环技术释放银纳米粒子；通过酸将纳米粒子转换为离子，与光电材料CdSe进行阳离子交换，使CdSe光电信号降低，实现对miRNA141的检测。 2.如权利要求1所述的基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法包括以下步骤： 第一步，制备3D纳米步行机； 第二步，制备DNA探针，修饰有磁珠的Probe 1 DNA与修饰有AgNPs的Probe 2 DNA杂交互补； 第四步，制备CdSe量子点并修饰到修饰一层TiO2的ITO电极上，检测电流信号； 第四步，将检测物质与第一步的产物共同孵育2h后，离心取上清液再与步骤S102的产物共同孵育，磁分离取上清液； 第五步，将第四步的上清液加入硝酸溶解后滴加到第三步的电极上进行阳离子交换，检测光电流信号；测得的光电流信号与第三步测得信号的差值与检测物浓度相关。 3.如权利要求2所述的基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述CdSe量子点的合成，将6.302gNa2SO3和1.579gSe粉溶于100mL去离子水中，加入250mL容量瓶，通N2升温至90℃，回流冷凝，至灰黑色悬浊液变澄清透明后；继续反应6h，停止加热，抽滤得到0.2mol/L的Na2SeSO3溶液； 将1.096g CdCl2·2.5(H2O)溶于水中，将0.84mL巯基丙酸用60mL去离子水稀释，与CdCl2水溶液一起加入250mL三口烧瓶，用1.0mol/L的NaOH水溶液调节pH至10.0；磁力搅拌下，将12mLNa2SeSO3溶液加入瓶中，加热至沸，回流4h，得CdSe量子点。 4.如权利要求2所述的基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述ITO电极的修饰，称取0.0010gTiO2，溶于50μL无水乙醇中，超声分散；取5μL所配TiO2溶液滴在洗净并用N2吹干的ITO电极表面，干燥后用去离子水洗净吹干；将修饰有TiO2的ITO电极依次浸没在2％聚二甲基二烯丙基氯化铵和CdSe溶液中15min，在TiO2表面修饰一层CdSe，检测光电流信号。 5.如权利要求2所述的基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述20nM AuNPs金纳米粒子的制备，向已泡过王水的圆底烧瓶中加入100mL 1.0×10-3mol·L-1的氯金酸，加热搅拌至溶液回流；反应后，将10mL 3.9×10-4mol·L-1的柠檬酸钠在搅拌的同时快速准确的加入到圆底烧瓶中，继续加热回流；溶液的颜色随即发生改变，由最初的淡黄色逐步变为深红色，继续回流15min后关掉加热，将反应体系自然冷却至室温后停止搅拌，得到粒径为20nM的球形金纳米粒子。 6.如权利要求2所述的基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述3D纳米步行机的制备，将10μL 1.0*10-6mol/L的Walking DNA与同浓度的ProtectingDNA在37℃水浴中杂交互补，取互补好的Walking DNA，和10μL 1.0*10-5mol/L Support DNA分别用TCEP活化巯基1h；将活化好的Walking DNA与Support DNA一起加入到1mL粒径为20nM的AuNPs中混匀，与摇床中过夜，离心洗涤3次后，重新分散到100μL pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，得到3D纳米步行机。 7.如权利要求2所述的基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述探针的制备，将10μL 1.0*10-5mol/L Probe 1 DNA用EDC和NHS溶液活化羧基，将活化后的Probe 1 DNA与100μL氨基修饰的磁珠混合，磁力离心洗涤，重新分散到100μLPBS中，得到修饰有磁珠的Probe 1 DNA； 另将10μL 1.0*10-5mol/L Probe 2 DNA加入1mL的AgNPs银纳米颗粒溶液中，放入摇床至少摇18h后，加入122μL 0.01mol/LPBS调节pH和离子强度，继续摇6h；之后每隔3h，向溶液中加入21μL2.0mol/L的NaCl溶液，最后再摇48h；离心洗涤，重新分散到100μL得到修饰有AgNPs的Probe 2 DNA； 分别取10μL修饰有磁珠的Probe 1 DNA与修饰有AgNPs的Probe 2 DNA杂交互补，备用。 8.如权利要求2所述的基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述检测miRNA141，在0.6mL的离心管中加入10μL 1.0*10-12mol/L的miRNA141，再加入10μL制备好的3D纳米步行机和2μL Nt.BsmAI剪切酶；加0.01mol/LPBS定容成50μL，在37℃水浴锅中孵育2h；miRNA141与Protecting DNA结合后，Walking DNA暴露出与Support DNA互补的序列；Walking DNA与Support DNA互补后形成Nt.BsmAI剪切酶的剪切位点，在SupportDNA上剪下一段DNA后，Walking DNA再与其他Support DNA结合剪切； 离心取上清液加入Probe 1 DNA与Probe 2 DNA杂交互补的结构中，加入1μLT7剪切酶，孵育2h；Nt.BsmAI剪切酶剪切下来的DNA片段与Probe 1 DNA和Probe 2 DNA杂交互补的结构结合，暴露出T7剪切酶剪切的5’端的凹末端，使得AgNPs游离到溶液中； 磁力分离后，取上清液加入10μL 1.0mmol/L硝酸酸解AgNPs，10min后得到Ag+；将酸解后的溶液滴到上述制备好的ITO电极上，反应10min，进行阳离子交换，对阳离子交换后的ITO电极进行光电流检测； 检测池采用ITO电极，铂丝电极，银/氯化银电极构成的三电极系统，取0.1056g抗坏血酸溶于6mL PBS作为电解液，检测光电流信号。 9.如权利要求8所述的基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法，其特征在于，所述测得的阳离子交换后的光电流信号与CdSe的光电流信号之间的差值与miRNA141浓度呈正比，miRNA141浓度越高，光电流信号的差值越大； miRNA141的检测浓度依次为1.0*10-13mol/L，1.0*10-14mol/L，1.0*10-15mol/L，1.0*10-16mol/L，1.0*10-17mol/L。 10.一种应用权利要求1～9任意一项所述基于循环扩增和阳离子交换检测核酸分子的方法的光致电化学传感器。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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