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原文传递重金属铅离子的检测方法

专利名称：	重金属铅离子的检测方法
摘要：	本发明公开了一种重金属铅离子的检测方法，通过在氨基化磁珠表面修饰纳米金，形成荧光淬灭体，然后纳米金通过Au‑S键与巯基化的DNA酶连接，并修饰上红色量子点，形成红色荧光探针，紧接着通过碱基互补配对与另一端修饰绿色量子点的底物链结合，最终形成比率荧光生物探针。在DNA作用下，Pb2+能够识别并剪切底物链，从而改变绿色量子点与纳米金之间的距离，实现绿色荧光的淬灭与恢复，最后通过绿色荧光强度的变化引发的红绿荧光比率的变化实现对Pb2+的定量检测。该方法具有简单、方便的特点，采用双信号检测模式，有效地了降低背景环境对检测结果的影响，减小了实验误差；该方法操作简便易行、检测成本低，能够通过荧光分光光度计实现对目标物的定量检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	湖北工业大学
发明人：	吴龙;李明月;刘静敏;陈小强
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-26T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-27T00:00:00+0800
申请号：	CN201910563707.6
公开号：	CN110286107A
代理机构：	武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	艾小倩
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	430068 湖北省武汉市武昌区南湖李家墩1村1号
主权项：	1.一种重金属铅离子的检测方法，其特征在于：它包括如下步骤： A材料的制备与修饰，步骤如下： (1)称取FeCl3·6H2O，乙二醇充分溶解后，加入聚丙烯酸，尿素，去离子水，超声溶解，最后移入聚四氟乙烯内衬的钢质水热釜反应； (2)量取Fe3O4纳米材料，超声分散，磁力搅拌条件下，加入质量分数为25％氨水，再以5～30μL/10min的频率加入正硅酸乙酯，室温反应； (3)将步骤(2)中溶液乙醇稀释，在磁力搅拌条件下，加入三氨丙基三乙氧基硅烷和质量分数为25％NH3·H2O，在室温下搅拌反应； (4)称取四氯金酸、柠檬酸三钠置于冰水浴中，加入现配现用的1mg/mLNaBH4溶液反应； (5)称取ZnCl2、CdCl2·2.5H2O分别溶解于去离子水中，逐滴加入巯基丙酸，然后用NaOH溶液分别调节pH至8.5；加热回流搅，在ZnCl2溶液中加入Na2S·9H2O溶液，制备壳层前驱体溶液，在CdCl2·2.5H2O溶液中加入0.05～0.3gNaBH4和0.05～0.3g硒粉，在通入氮气的条件下，前驱体溶液在100℃下水浴回流反应，当溶液颜色逐渐变为橙红色时，反应结束；在已合成的CdSe量子点溶液中快速注入壳层前驱体溶液，并加热回流，制备发射红绿色荧光的CdSe@ZnS核壳结构量子点； B比率荧光生物探针的构建，步骤如下： (6)取氨基化磁珠，加入纳米金溶液，超声震荡，磁分离去除上清，加入柠檬酸缓冲溶液，加入SH-DNA后孵育，再加入经EDC活化的修饰有巯基丙酸的红光CdSe@ZnS量子点孵育，制备得到红色荧光探针； (7)取经EDC活化的巯基丙酸绿光量子点，加入末端修饰氨基的DNA混合孵育，制备得到绿色荧光探针； (8)取红色荧光探针，再加入绿色荧光探针；调节溶液pH，水浴加热，孵育后，关闭水浴锅冷却至室温，探针构建完成；在紫外灯下溶液呈现红色荧光；将样品提取液加入到检测重金属铅离子的比率荧光生物探针反应是指在室温下反应，其反应时间为0～10min，调节探针的pH分别至3.0，5.0，7.0，9.0，11.0，测定I540/I630的比值，计算样品中铅离子的浓度； C检测样茶叶的处理和铅离子检测标准曲线的制备如下： C-1.称取1g茶叶于瓷坩埚中移入马弗炉500℃±25℃灰化6～8h冷却，后加入2mLHCl，在电炉上加热至烧干，用0.5％的硝酸将灰分溶解，用滴管将试样洗入10mL或25mL的容量瓶中，定容至刻度； C-2.采用上述方法制备的比率荧光生物探针分别用以下9个标准铅离子溶液处理，摩尔浓度分别为a)10-5μg/mL；b)10-4μg/mL；c)10-3μg/mL；d)3×10-3μg/mL；e)6×10-3μg/mL；f)10-2μg/mL；g)3×10-2μg/mL；h)6×10-2μg/mL；i)0.1μg/mL；在室温下，分别调节探针溶液pH为3，5，7，9，11，孵育时间0～600s；比较在不同的铅离子浓度下，比率荧光强度I540/I630的变化；所述步骤C-1将样品提取液加入到检测金属铅的比率荧光生物探针中，控制环境的pH，以及反应时间，通过荧光分光光度计测定并计算I540/I630的比值；所述步骤C-2用所述检测金属铅离子的比率荧光生物探针检测铅离子样品溶液，并根据铅离子标准曲线进行计算，得到待测样品铅离子的含量或范围值。 2.根据权利要求1所述的重金属铅离子的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为FeCl3·6H2O为0.81g，乙二醇溶液为30mL，聚丙烯酸为20g，去离子水500μL和尿素1.80g，搅拌充分溶解后，超声时间为10分钟混合，加入聚四氟乙烯内衬的钢质水热釜的容积为50mL的中，反应温度200℃，反应时间为10～16小时，然后冷却至室温；所述步骤(2)具体为取步骤(1)中Fe3O4纳米材料为2mL，超声分散，在转速为500rpm条件下，加入0.5～0.95mL、质量分数25％的氨水并搅拌5～10分钟，加入正硅酸乙酯的量为50-100μL，所述体积比正硅酸乙酯:水为1:1，加样量为10～20μL/10min并在室温下不断搅拌反应10～16小时；所述步骤(3)具体为取步骤(2)中溶液500μL，无水乙醇定容5mL，三氨丙基三乙氧基硅烷的量为8～20μL，25％NH3·H2O为100～300μL，在室温下搅拌反应10～16小时；所述步骤(4)具体为20～50mL、0.25mM四氯金酸和6～7mg柠檬酸三钠置于冰水浴中，新配置的0.1M NaBH4为1～2mL，反应时间15～30分钟；所述步骤(5)具体为称取ZnCl2和CdCl2·2.5H2O为0.1～0.2g和0.3～0.6g分别溶解于100mL去离子水中，巯基丙酸为0.2～0.5mL，分别用NaOH溶液调节pH至8.5；在100℃条件下加热回流搅拌15～60分钟，在ZnCl2溶液中加入Na2S·9H2O的量为0.2～0.4g，制备壳层前驱体溶液；在CdCl2·2.5H2O中加入NaBH4和硒粉的量分别为0.05～0.2g和0.1～0.2g，在通入氮气的条件下，前驱体溶液在100℃下水浴回流反应，得到CdSe量子点溶液；在已合成的CdSe量子点溶液中快速注入壳层前驱体溶液，100℃加热回流，得到发射红绿色荧光的CdSe@ZnS核壳结构量子点。 3.根据权利要求1或2所述的重金属铅离子的检测方法，其特征在于：所述步骤(6)具体为氨基化磁珠为0.5～1mL，纳米金溶液为1～3mL，氨基化磁珠与纳米金体积比1:4，超声震荡2～5min，磁分离去除上清，加入柠檬酸缓冲溶液为0.5～1mL；SH-DNA的浓度为20μM加入量为25.1～50.2μL，孵育30～90min；加入红光CdSe@ZnS量子点100～500μL孵育1～4h；制备得到红色荧光探针，在紫外灯下，溶液呈现红色荧光；所述步骤(7)具体为取50～200μL修饰有巯基丙酸的绿光CdSe@ZnS量子点加入100～500μLEDC活化，再与浓度为20μM末端修饰氨基的DNA30～72μL混合，孵育1～4h，制备得到绿色荧光探针，在紫外灯下，溶液呈现绿色荧光；所述步骤(8)具体为取红色荧光探针50～250μL，绿色荧光探针50～250μL，绿色荧光探针为50μL，将混合探针放入温度为75℃的水浴锅中，调水浴锅温度到25～65℃自然冷却，过程持续10-30min；关闭水浴锅冷却至室温，探针构建完成，在紫外灯下溶液呈现红色荧光。 4.根据权利要求1或2所述的重金属铅离子的检测方法，其特征在于：所述步骤C-2具体为，采用上述方法制备的比率荧光生物探针分别用以下9个标准铅离子溶液处理，当探针溶液pH为9，孵育时间300s时，在此范围比率荧光生物探针的荧光强度I540/I630的比值与铅离子浓度的对数具有线性相关性。 5.根据权利要求3所述的重金属铅离子的检测方法，其特征在于：所述步骤C-2具体为，采用上述方法制备的比率荧光生物探针分别用以下9个标准铅离子溶液处理，当探针溶液pH为9，孵育时间300s时，在此范围比率荧光生物探针的荧光强度I540/I630的比值与铅离子浓度的对数具有线性相关性。
所属类别：	发明专利