详情

原文传递一种泛素链固相检测方法和应用

专利名称：	一种泛素链固相检测方法和应用
摘要：	本发明涉及生物样本中蛋白质泛素化修饰的高效、灵敏且无偏性的检测方法。以由两个不同的泛素结合结构域串联而成且N端含有标签蛋白(GST)的人工合成多肽(ThUBD)作为检测试剂。与通用的商业化泛素抗体相比，本发明提供的检测试剂以及固相检测方法能够高效、无偏性的识别泛素分子形成的8种不同泛素链，实现对生物样本内源泛素链的无偏性检测；可以显著提高泛素化蛋白质的检测灵敏度。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京蛋白质组研究中心
发明人：	李衍常;徐平;肖伟弟;高媛;常蕾;高慧英
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-06T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910491358.1
公开号：	CN110308281A
代理机构：	北京律诚同业知识产权代理有限公司
代理人：	黄韧敏
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100000 北京市昌平区科学园路33号1号楼
主权项：	1.一种检测生物样本中蛋白质泛素链修饰的检测方法，其中所述方法以带有通用标签的杂种泛素结合结构域多肽作为检测试剂。 2.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述检测为将杂种泛素结合结构域多肽作为诱饵蛋白，结合Far-western blotting技术检测生物样本中蛋白质泛素链修饰。 3.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述杂种泛素结合结构域多肽为如下(A)或(B)多肽： (A)由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成； (B)由至少两个相同的或不同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成。 4.根据权利要求1至3任一项所述的检测方法，其中所述杂种泛素结合结构域多肽1选自： (a)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域； (b)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域；n为大于等于2的整数； (c)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域；和 (d)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域；n为大于等于2的整数。 5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其中所述通用标签为与所述杂种泛素结合结构域多肽连接的一标签蛋白，所述标签蛋白为能够进行免疫反应检测的标签蛋白。 6.根据权利要求5所述的检测方法，其中所述标签蛋白选自：谷胱甘肽-S-转移酶标签、His标签、Flag标签、HA标签、Myc标签、纤维素结合域标签和钙调蛋白标签。 7.根据权利要求6所述的检测方法，其中所述标签蛋白为谷胱甘肽-S-转移酶标签。 8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其中所述方法为固相检测方法，包括如下步骤： (1)从待测样品中分离提取蛋白质组或者特定靶蛋白； (2)以步骤(1)获得的蛋白质，进行凝胶电泳，并转膜至NC或PVDF固相膜上，5-10％的脱脂奶粉封闭； (3)对步骤(2)得到的NC或者PVDF膜与诱饵蛋白进行孵育结合； (4)将步骤(3)的固相膜与所述诱饵蛋白所携带标签蛋白的特异性抗体进行二次孵育，显色；其中所述诱饵蛋白为所述杂种泛素结合结构域多肽。 9.一种检测试剂盒，包含下述材料的至少一种： (i)一所述的杂种泛素结合结构域多肽； (ii)一固相吸附剂，所述固相吸附剂为将所述杂种泛素结合结构域多肽固定于固相载体上后所得；或 (iii)一层析柱，以(ii)中的所述固相吸附剂做为填料。 10.泛素结合结构域多肽在检测泛素化蛋白质中的应用，其中所述泛素结合结构域多肽为人工构建的杂种泛素结合结构域多肽，选自： (A)由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成；和 (B)由至少两个相同的或不同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成。
所属类别：	发明专利