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原文传递一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法

专利名称：	一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法
摘要：	本发明公开了一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法。该方法包括下述步骤：1)配制含有NNAL、可替宁、同位素标记的NNAL、同位素标记的可替宁的单一标准品储备溶液；2)分别配制含有NNAL、可替宁的系列浓度的混合标样工作液，制成标准曲线；3)取待测尿样，加入含同位素标记内标的磷酸盐缓冲溶液，加入15‑25μLβ‑葡萄糖醛酸苷酶酶解；4)将酶解后的样液取出并放置至常温，进行固相萃取，进行仪器分析，根据步骤2)制成的标准曲线计算得到NNAL和可替宁的含量。该方法有效解决了现有的尿液中NNAL和可替宁的同时测试方法前处理繁琐、耗时长的问题，同时大大降低了尿液中的基质效应，提高了检测灵敏度和准确性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	四川;51
申请人：	四川大学
发明人：	邹晓莉;袁悦;王文佳;杨明岐;王焱;郑波;曾红燕
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910650653.7
公开号：	CN110333308A
代理机构：	成都蓉创智汇知识产权代理有限公司
代理人：	谭新民
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	610000 四川省成都市武侯区一环路南一段24号
主权项：	1.一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，包括下述步骤： 1)分别配制含有4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁、同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的单一标准品储备溶液； 2)分别配制含有4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的系列浓度的混合标样工作液，系列浓度的混合标样工作液中，同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的浓度保持不变，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度成比例增大；将系列浓度的混合标样工作液注入色谱柱进行仪器分析，制成标准曲线； 3)取待测尿样，加入含同位素标记内标的磷酸盐缓冲溶液，尿样与磷酸盐缓冲溶液的体积比为8-12:1，所述磷酸盐缓冲溶液中同位素标记4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇和同位素标记的可替宁浓度为10ng/L和100μg/L，加入15-25μLβ-葡萄糖醛酸苷酶酶解，混合后，于36-38℃恒温放置4～24小时； 4)将步骤3)酶解后的样液取出并放置至常温，选用PRiME HLB固相萃取柱进行固相萃取，固相萃取柱先以甲醇和超纯水活化平衡，然后以乙酸乙酯作为洗脱液洗脱，收集洗脱液；取部分洗脱液以恒流氮气将洗脱液吹蒸至干，乙腈充分复溶后，取上清液进样进行仪器分析用于检测4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇，另一部分洗脱液直接上样用于检测可替宁，根据步骤2)制成的标准曲线计算得到4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇和可替宁的含量。 2.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤2)中，以4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度为横坐标，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁与同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的比值为纵坐标，制成标准曲线。 3.根据权利要求2所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤2)所述系列浓度的混合标样工作液中，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇的浓度范围是0～3000ng/L，可替宁的浓度范围是0～400μg/L；标准曲线绘制方法为：取NNAL和可替宁标准品储备溶液，以乙腈为溶剂配制得到NNAL浓度为0、5、10、20、50、100、300、600、3000ng/L以及可替宁浓度为0、10、20、50、80、100、200、300、400μg/L的系列标准混合溶液，系列标准混合溶液中13C6-NNAL、D3-尼古丁的浓度保持不变；将系列标准混合溶液注入液相色谱-串联质谱条件进行检测，以4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁的浓度为横坐标，4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、可替宁与同位素标记的4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇、同位素标记的可替宁的峰面积的比值为纵坐标，制成标准曲线。 4.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤4)中，以甲醇和超纯水活化平衡的具体步骤为：取步骤3)酶解后的样液的上层清液上样，流出速度控制为每滴2-4s；淋洗采用体积比为5％甲醇水溶液，流出速度控制为每滴2-4s，完成后以空气吹干固相萃取柱。 5.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤3)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4，尿样与磷酸盐缓冲溶液的体积比为8-12:1；β-葡萄糖醛酸苷酶的加入量为15-25μL。 6.根据权利要求5所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤2)和3)中所述仪器分析为亲水作用液相色谱串联质谱法分析。 7.根据权利要求6所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，所述液相色谱仪采用ACQUITYBEH HILIC色谱柱进行色谱分离；色谱条件为：流动相A为3mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为纯乙腈，采用梯度洗脱：0～0.8min保持流动相B97％，0.8～0.9min流动相B降至75％，0.9～4.0min保持流动相B比例为75％，4.0～4.2min流动相B上升至97％，4.2～10min保持流动相B比例为97％；流速为0.3mL/min；进样量5μL；柱温箱温度恒定为40℃，单次进样运行时间为10min。 8.根据权利要求6所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，质谱条件为：采用电喷雾电离源，扫描模式为正离子模式，多反应监测模式下检测；待测物扫描时间均为0.309s，采集时间为0～7.0min；仪器其它参数为：接口电压4.0kV；雾化气为高纯氮气，3L/min；加热气为无水空气，10L/min；干燥气为氮气，10L/min；碰撞气为氩气，270kPa；接口温度300℃；DL管温度250℃；加热块温度400℃；多反应监测模式参数和其它的质谱条件为： *为定量离子。 9.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，PRiME HLB固相萃取柱为60mg/3cc小柱。 10.根据权利要求1所述的一种灵敏度、准确性高的同时测定尿液中NNAL和可替宁的方法，其特征在于，步骤1)中各标准储备溶液制备方法为： 4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇标准储备溶液：称取适量4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇标准品，以乙腈为溶剂溶解并定容，配制成500mg/L NNAL的标准储备溶液； 13C6-NNAL标准储备溶液：称取适量13C6-NNAL标准品，乙腈为溶剂溶解并定容，配制成50mg/L13C6-NNAL的同位素标准溶液； D3-可替宁标准储备液：称取10mg D3-可替宁，以10mL乙腈溶解，配制成1.0g/L标准储备溶液；可替宁标准储备溶液：1.0g/L可替宁标准储备溶液。
所属类别：	发明专利