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原文传递一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法

专利名称：	一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法
摘要：	一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，涉及生物医药分析领域，包括以下步骤：1）将黑鲷幼鱼均分为实验组和空白组；2）在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖；3）将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，麻醉后，取出肝脏组织，保存备用；4）制备肝脏组织样品，同时制备质控样品，使用超高效液相色谱‑飞行时间质谱联用技术进行处理；5）收集得到的黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物，并对肝脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析。本发明系统性好，准确性高，成本低，操作简单。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心
发明人：	周秀锦;张静;邵宏宏;晁铎源;宋立玲
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-18T00:00:00+0800
申请号：	CN201910526781.0
公开号：	CN110346466A
代理机构：	杭州杭诚专利事务所有限公司
代理人：	尉伟敏
分类号：	G01N30/02(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	316000 浙江省舟山市定海区昌国路222号
主权项：	1.一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1)将用于动物实验的黑鲷幼鱼随机均分为实验组和空白组； 2)采用相同的饲料饲喂实验组和空白组，并在实验组的饲料中加入硒化氨基多糖； 3)饲喂结束后将实验组和空白组的黑鲷幼鱼进行饥饿处理，并用麻醉剂麻醉后，取出肝脏组织，保存备用； 4)制备肝脏组织样品和质控样品，随后使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理，进样时质控样品穿插于肝脏组织样品之间； 5)对超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术所收集得到的黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理，识别并筛选出关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物，并对肝脏代谢组学生物标志物指向的代谢通路进行构建和分析。 2.根据权利要求1所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将黑鲷幼鱼进行停饲处理，随后放入玻璃纤维缸内微流水式饲养；步骤2)中实验组和空白组饲喂具体方法为：将实验组和空白组采用普通饲料进行饲喂，并在实验组普通饲料中添加0.5～0.7mg Se/kg的硒化氨基多糖，连续饲喂8-10周；步骤3)中饲喂结束后黑鲷幼鱼处理的具体方法为：将实验组和空白组的黑鲷幼鱼饥饿20-30h后，用麻醉剂麻醉，取出肝脏组织，实验组和空白组各取数量相同的平行样，随后进行称重，并用液氮快速冷冻，最后放置于-80℃的超低温冰箱中保存，备用；步骤4)中所述肝脏组织样品制备方法为：取备用肝脏组织于离心管，加入-10～-30℃冷冻的5-15倍体积的甲醇，10000-14000rpm下均质0.5-1.5min后，在4℃下，12000-14000rpm下离心3-5min，取上清液在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶，肝脏组织样品制备在12min内完成；质控样品制备方法为：取上述各个肝脏组织样品制备中的上清液混合均匀，在30-50℃下氮气吹干，并用甲醇水溶液复溶；步骤4)中使用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术进行处理的具体方法为：将肝脏组织样品经微孔滤膜过滤之后，在固定的色谱条件和质谱条件下，进入超高效液相色谱-质谱联用仪分析，其中，在液相色谱中C18和HILLIC两种色谱柱结合使用，并且，在检测过程中，每隔相同数量的肝脏组织样品插入一个质控样品进行检测分析，以监控检测稳定性；步骤5)中黑鲷肝脏代谢组学数据进行分析处理的具体方法为：利用XCMSplus对采集的黑鲷肝脏代谢组学数据进行全面的非靶向代谢组学分析，采用Centwave特征检测算法进行峰的发现和匹配，找到有差异的生物标志物，XCMS Plus软件会自动链接到METLIN数据谱库，并结合内源性代谢物二级谱库，根据与谱库中化合物的精确一级m/z、同位素丰度比一级和二级质谱信息，鉴定得出有差异的生物标志物，并把这些生物标志物通过聚类分析，找出代谢通路。 3.根据权利要求1或2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，关于硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强的肝脏代谢组学生物标志物共有32个，分别为：L-组氨酸、二甲基甘氨酸、4-胍基丁酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、琥珀酸、腺嘌呤、腺苷、脱氧肌苷、肌苷、脱氧鸟苷、鸟苷、甜菜碱、L-蛋氨酸、甘油酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酰胺、L-丝氨酸、腺苷一磷酸、脱氧腺苷一磷酸、γ-氨基丁酸、L-谷氨酸、D-核酮糖5-磷酸、鸟苷一磷酸、鸟氨酸、L-精氨酸、肌酸、精氨基琥珀酸。 4.根据权利要求1或2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，生物标志物主要指向7条代谢通路，分别为：氨酰基-tRNA生物合成、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、嘌呤代谢、氮代谢、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢。 5.根据权利要求2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，C18色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：40℃，流动相A为2mmol/L甲酸铵和0.05％甲酸水溶液，流动相B为乙腈和间苯二甲酸混合液，且乙腈和间苯二甲酸的体积比为1:1，进样量：2μL，流动相梯度洗脱如下表所示： HILLIC色谱柱色谱条件为：流速：0.3ml/min，进样盘温度：4℃，柱温：45℃，流动相C为10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸水溶液，流动相D为乙腈水溶液，其中乙腈和水体积比为95:5，且水中含有10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸，进样量：1μL，流动相梯度洗脱如下表所示。 6.根据权利要求2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述质谱条件为：采用电喷雾离子化源正、负离子扫描模式，喷雾电压：正离子5500V，负离子-4500V；离子化温度：550℃；雾化气：60psi；辅助加热气：60psi；气帘气：35psi；一级质谱采集范围为m/z 100～1250，累积时间0.10s；DP：80V；采用IDA模式采集二级质谱，采集范围为m/z 50～1250，累积时间0.05000s，DP：80V；CE:40±20eV；IDA转换标准为：信号强度＞100cps，分子量误差50mDa，在4Da内排除同位素。 7.根据权利要求1或2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述用于动物实验的黑鲷幼鱼体质健康、大小均匀，且初始体重为12.8～13.2g。 8.根据权利要求1或2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述硒化氨基多糖的硒含量为27.3mg/g。 9.根据权利要求1或2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述麻醉剂为MS-222，浓度为60mg/L。 10.根据权利要求1或2所述的一种基于肝脏代谢组学研究硒化氨基多糖对黑鲷免疫机制增强模型的构建方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为4:1。
所属类别：	发明专利