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原文传递一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法

专利名称：	一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法
摘要：	本发明属于代谢组学技术领域，具体涉及一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法。本发明采用核磁共振技术检测二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后的尿液代谢物，通过多元统计分析方法发现二乙基亚硝胺致肝癌的生物标志物，复方苦参注射液对上述生物标志物均有回调，以此来实现复方苦参注射液治疗肝癌机制的识别及高通量分析。本发明要解决现有药理学评价方法单一，不能系统、全面地评价中药作用机制的问题。通过对生物标志物进行通路分析，可更全面、高效、快速的从整体水平无偏向性的综合评价复方苦参注射液治疗肝癌作用机制，为中药代谢组学及作用机制的阐明提供示范性研究。
专利类型：	发明专利
申请人：	山西大学
发明人：	王珂欣;高丽;杜冠华;秦雪梅
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T00:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T10:00:00+0805
申请号：	CN201911362181.1
公开号：	CN110988008A
代理机构：	太原申立德知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	程园园
分类号：	G01N24/08;G;G01;G01N;G01N24;G01N24/08
申请人地址：	030006 山西省太原市坞城路92号
主权项：	1.一种基于代谢组学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究方法，其特征在于：采用核磁共振技术检测二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物；对获得的1H-NMR图谱进行代谢轮廓分析，获得数据集；对数据集利用多元变量统计分析方法筛选出具有治疗肝癌作用的潜在尿液生物标志物，利用复方苦参注射液对生物标志物含量的回调变化来实现复方苦参注射液治疗肝癌作用机制的识别及高通量分析；通过对生物标志物进行通路富集分析，筛选出复方苦参注射液治疗肝癌的主要代谢通路。 2.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述二乙基亚硝胺致肝癌大鼠模型的构建方法为：将大鼠随机分为空白对照组与二乙基亚硝胺致肝癌模型组，肝癌模型组大鼠自由饮用60mg/L由灭菌水配置的二乙基亚硝胺溶液，每天按照饮用情况更换，建立肝癌大鼠模型。 3.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述复方苦参注射液干预二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的具体方法为：对造模成功的肝癌大鼠按随机原则分为模型组和复方苦参注射液治疗组，每组10只大鼠，复方苦参注射液治疗组按2mL/kg尾静脉注射给药，空白对照组和模型组注射相同体积质量浓度为0.9％的氯化钠溶液，连续三周。 4.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述采用核磁共振技术检测干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物之前需对尿液代谢物进行处理，具体方法为：尿液代谢物中尿液的保存：在给药结束后收集各组大鼠的尿液样本，-80℃储存；尿液代谢物中尿液的前处理：4℃解冻尿液样本，取500μL尿液样品加入200μL磷酸盐缓冲液，0.2M NaH2PO4/NaHPO4，10％D2O，0.01％TSP，pH＝7.4，涡旋，于4℃，13000r/min离心10min，取600μL上清液用于核磁测定。 5.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述采用核磁共振技术检测二乙基亚硝胺致肝癌大鼠及复方苦参注射液干预后二乙基亚硝胺致肝癌大鼠的尿液代谢物的条件如下：样品于25℃600MHz NMR仪上测定，采用NOE-2D Spectroscopy脉冲序列；测定频率为600.13MHz，扫描次数为64，谱宽12345.7Hz，脉冲时间14s，采样时间2.654s，延迟时间1.0s，采样数据点65 536，FID分辨率0.188Hz，采样间隔40.5s，内标为TSP。 6.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述对获得的1H-NMR图谱数据进行代谢轮廓分析，获得数据集的具体过程为：采用核磁图谱专业处理软件对NMR进行傅里叶转换，并进行手动相位，基线校正后，对所有图谱中以TSP校准化学位移，以δ0.01对化学位移区间δ0.30-9.50进行分段积分，排除δ4.70-5.00区域的水峰不进行积分，并将积分数据进行归一化；最终导出积分数据矩阵。 7.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述对数据集利用多元变量统计分析方法筛选出具有治疗肝癌作用的潜在尿液生物标志物的方法：积分数据矩阵，导入到SIMCA-P软件进行生物标志物的寻找：对空白对照组与二乙基亚硝胺致肝癌模型组尿液代谢轮廓数据进行偏最小二乘法判别分析和正交偏最小二乘法判别分析，对OPLS-DA结果进行分析，得到VIP值，选出VIP＞1的代谢产物，依据S-plot图并结合独立样本t检验p＜0.05筛选出生物标志物。 8.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：利用复方苦参注射液对生物标志物含量的回调变化的具体方法为：对筛选出的生物标志物含量变化分析，得到21个潜在生物标志物，这21个潜在标志物含量在肝癌大鼠模型组中均降低，经复方苦参注射液治疗后含量升高，且复方苦参注射液对标志物异亮氨酸、甲基丙二酸、N-乙酰糖蛋白和肌酸含量有显著的回调作用。 9.根据权利要求8所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述21个潜在生物标志物具体为：丁酸、α-羟基丁酸、泛酸、异亮氨酸、3-羟基丁酸、甲基丙二酸、乳酸、2-羟基异丁酸、丙氨酸、瓜氨酸、醋酸、N-乙酰糖蛋白、丙酮、丙酮酸、琥珀酸、甲胺、二甲基甘氨酸、丙二酸二乙酯、牛磺酸、甘氨酸和肌酸。 10.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学预测复方苦参注射液治疗肝癌机制的研究方法，其特征在于：所述通路富集分析的具体方法为：将复方苦参注射液显著回调的潜在生物标志物导入MetaboAnalyst、KEGG数据库分析潜在生物标志物的相关代谢通路，依据代谢通路分析所得影响值大小、代谢通路的p值和通路重要值，确定精氨酸和脯氨酸代谢与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解这两条代谢通路为复方苦参注射液治疗肝癌的重要代谢通路，参与了复方苦参注射液治疗肝癌的主要代谢过程，形成相互交错的代谢网络，完整的阐释了复方苦参注射液治疗肝癌的作用机制。
所属类别：	发明专利