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原文传递一种用于检测microRNA的纸基光电阴极生物传感器的制备方法

专利名称：	一种用于检测microRNA的纸基光电阴极生物传感器的制备方法
摘要：	本发明公开了一种用于检测microRNA的纸基光电阴极生物传感器的制备方法。在纸基碳工作电极的工作区域首先包覆金纳米粒子层，然后电沉积多面体状的氧化亚铜，其可以负载大量的硫化银量子点，形成光电敏化结构，极大地增强阴极光电流；在目标microRNA存在的条件下，基于双链特异性核酸酶诱导的目标物循环反应和级联的干‑支杂交链反应，获得带负电荷的树枝状的DNA双螺旋结构，通过组装带正电荷的金纳米粒子，形成具有良好的葡萄糖氧化酶模拟活性的金树，其可以催化葡萄糖氧化反应，消耗电子受体溶解氧，降低阴极光电流信号，实现对microRNA的灵敏检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	于京华;杨红梅;胡孟苏;张彦;颜梅;葛慎光
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-18T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910651279.2
公开号：	CN110376259A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	赵凤
分类号：	G01N27/30(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号
主权项：	1.一种用于检测microRNA的纸基光电阴极生物传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）利用计算机软件Adobe illustrator CS6设计纸芯片的蜡打印图案，通过型号为Color Qube 8580的商用蜡打印机将设计好的蜡打印图案打印在色谱纸上，然后在150 ℃的烘箱中加热30 s，使蜡融化并完全渗透到纸纤维网络中，获得全蜡的疏水区域和未蜡染的亲水区域；（2）利用计算机软件Adobe illustrator CS6设计碳对电极、Ag/AgCl参比电极和碳工作电极的印刷图案，通过丝网印刷技术将碳对电极、Ag/AgCl参比电极和碳工作电极印刷在步骤（1）中获得的未蜡染的亲水区域；（3）在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长致密的金纳米粒子层，具体的过程分为两步：第一步是合成金种子，首先将0.4-0.6 mL质量分数为0.05%-2%的氯金酸稀释到40-60 mL的超纯水中，并加热至沸腾，然后在磁力搅拌下加入0.2-0.5 mL质量分数为1%-5%的柠檬酸钠，继续加热1-5 min后，自然冷却到室温，获得酒红色的溶液；第二步是在碳工作电极的工作区域原位生长金纳米粒子层，将获得的30-50 μL金种子滴涂到工作区域并在室温下自然干燥，重复上述“滴涂-干燥”过程4-6次后，在工作区域滴加30-50 μL新制备的盐酸羟胺和氯金酸的混合液，所述的盐酸羟胺的浓度为100-300 mM，氯金酸的浓度为20-30mM，在4 ℃条件下反应30-60 min后，用超纯水洗涤并在室温下自然干燥；（4）利用由碳对电极、Ag/AgCl参比电极和碳工作电极组成的三电极系统在步骤（3）中获得的碳工作电极的工作区域电沉积多面体状的氧化亚铜，沉积电解液由浓度为0.4 M的乳酸和浓度为0.02 M的醋酸铜组成，沉积电解液的pH由浓度为2 M的氢氧化钠调节至11，沉积电压为-0.4 V，沉积温度为60 ℃，沉积时间为30 min，沉积完成后，用超纯水洗涤工作区域表面，并在室温下自然干燥；（5）合成硫化银量子点：首先将20-40 μL 3-巯基丙酸稀释到60-80 mL除氧的超纯水中，然后用浓度为2 M的氢氧化钠和浓度为2 M的乙酸将溶液的pH调节至6-8，继续加入0.04-0.06 mmol的硝酸银，随后溶液的pH被重新调节至6-8，在70-100 ℃的条件下加热反应2-4 h后，缓慢加入4-6 mL浓度为4-6 mM的除氧的硫化钠溶液，最后将获得的棕色溶液离心洗涤3次，并重新溶解在20 mL浓度为0.01 M的氢氧化钠溶液中；（6）双链特异性核酸酶诱导的目标物循环反应：将5 μL不同浓度的目标microRNA与5 μL浓度为5.0 μM的信号传导DNA发夹探针、2 μL浓度为 0.5 U的双链特异性核酸酶以及3 μLTris-HCl缓冲溶液混合，所述的Tris-HCl缓冲溶液pH为8.0，浓度为50 mM且含有浓度为5mM的氯化镁、浓度为1 mM 的二硫苏糖醇，获得的混合液在60 ℃条件下反应1 h后，加入10μL浓度为10 mM的乙二胺四乙酸，并在50 ℃条件下反应5 min，最后在90 ℃条件下加热20min，完全终止目标物循环反应，获得双链特异性核酸酶诱导的目标物循环反应产物；（7）纸基光电阴极生物传感器的构建：将20 μL质量分数为2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷滴加到步骤（4）中获得的碳工作电极的工作区域并在室温下孵化40 min，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤后，继续滴加20 μL由浓度为20 mM的N-羟基琥珀酰亚胺和浓度为10 mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及步骤（5）中获得的硫化银量子点组成的混合液，其中磷酸盐缓冲溶液简写为PBS，孵化50 min后用pH 7.4的PBS洗涤，然后滴加20 μL浓度为5.0 μM的带有引链的DNA发夹探针，所用的带有引链的DNA发夹探针3′端带有氨基，在4 ℃条件下孵化12 h后用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的带有引链的DNA发夹探针，随后滴加20 mL浓度为1 mM的6-羟基-1-己硫醇用于封堵非特异性吸附位点，并在室温下孵化1 h，用pH 7.4的PBS洗涤后，将步骤（6）中获得的双链特异性核酸酶诱导的目标物循环反应产物滴加到工作区域表面，在37 ℃条件下孵化1 h后用pH 7.4的PBS洗涤，随后滴加20 μL浓度均为10 mM的用于主干上杂交链反应的DNA发夹探针1和DNA发夹探针2的混合液，并在37 ℃条件下反应2 h，用pH 7.4的PBS洗涤后，继续滴加20 μL浓度均为10 mM的用于分支上杂交链反应的DNA发夹探针3和DNA发夹探针4的混合液，在37 ℃条件下反应2 h后用pH 7.4的PBS洗涤，获得带负电荷的树枝状的DNA双螺旋结构，最后将20 μL带正电荷的金纳米粒子滴加到工作区域，所用的带正电荷的金纳米粒子的制备过程如下：在磁力搅拌下，首先将1.0-5.0 mL质量分数为1%-5%的氯金酸稀释到80-120 mL的超纯水中，然后加入2.0-6.0 mL浓度为2.0-4.0 mM的十六烷基三甲基溴化胺，继续搅拌1-5 min，随后加入1.0-5.0 mL新制备的浓度为0.1-0.4 M的硼氢化钠，搅拌5-10 min后，获得紫红色的溶液，基于静电相互作用，带正电荷的金纳米粒子被吸附到带负电荷的树枝状的DNA双螺旋结构上，获得具有良好的葡萄糖氧化酶模拟活性的金树；（8）光电阴极信号检测：利用由碳对电极、Ag/AgCl参比电极和步骤（7）中获得的碳工作电极组成的三电极系统，通过电流-时间曲线法进行光电阴极信号检测，所用的检测溶液为20 μL含有60 mM葡萄糖的pH 7.4的PBS，激发光波长范围为200-2500 nm，电压为0.0V，激发光源开关每隔20 s切换一次，随着目标microRNA浓度的增加，金树的量增加，基于金树良好的葡萄糖氧化酶模拟活性，其可以催化葡萄糖氧化反应，消耗电子受体溶解氧，导致阴极光电流信号降低，通过目标microRNA的浓度与阴极光电流信号之间的关系，实现对目标microRNA的定量检测。
所属类别：	发明专利