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原文传递一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法

专利名称：	一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法
摘要：	本发明公开了一种高灵敏的检测microRNA的纸基光电化学传感器。利用蜡打印技术制备纸芯片，并在其亲水工作区域原位生长金纳米颗粒实现纸芯片的功能化，随后修饰氧化亚铜/硫化铋/钒酸铋三级敏化物，通过固定的发夹DNA链对microRNA进行捕获，通过双链特异性核酸酶的特异性的识别和酶切作用，实现对microRNA的信号放大，随后通过多支杂交链反应，在链的主干部分嵌入铂纳米粒子，枝干部分形成氯化血红素/G‑四联体结构，形成具有类过氧化氢酶生物特性的DNA多联体，进一步实现信号的放大，从而完成光电化学传感器的制备，实现对microRNA的超灵敏、准确检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	于京华;李正林;杨红梅;胡孟苏;颜梅;葛慎光
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910741197.7
公开号：	CN110412097A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	赵凤
分类号：	G01N27/30(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	250022 山东省济南市南辛庄西路336号
主权项：	1.一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案，将设计好的打印图案通过蜡打印机打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸放在烘箱中，在130 ℃加热60秒使蜡融化并渗透整个色谱纸，形成疏水区域和亲水的工作区域；（2）在计算机上设计与步骤（1）中获得的蜡打印图案相匹配的工作电极、对电极和参比电极的印刷图案，并利用丝网印刷技术在步骤（1）中获得的蜡打印色谱纸上印刷碳工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极；（3）利用原位生长法在步骤（2）中获得的碳工作电极的工作区域生长金纳米颗粒，其具体步骤为：首先合成金纳米粒子：量取60-90 mL二次水置于三口烧瓶中并加热到90 ℃，然后加入0.5-0.9 mL质量分数为1%的氯金酸，继续水浴加热到96 ℃，待反应进行1 min后，立即加入2.5-2.9 mL 质量分数为1%的柠檬酸钠，在磁力搅拌下反应15-20 min，获得金纳米粒子溶液；然后采用“滴涂-干燥”法首先在碳工作电极的工作区域的滴涂10-20 μL金纳米粒子溶液，在室温下自然干燥，重复该操作3-5次，取10-20 μL新鲜制备的质量分数为1%的氯金酸和0.2 M的盐酸羟胺的混合溶液滴加到工作区域，所述的两种溶液体积比为1:1，在室温下生长20-40 min后，用二次水清洗工作区域并在室温下自然干燥30 min；（4）利用电沉积方法将小面状的氧化亚铜（Cu2O）修饰在步骤（3）中获得的碳工作电极的工作区域并将钒酸铋（BiVO4）/硫化铋（Bi2S3）复合物修饰在Cu2O上；（5）将发夹DNA链S1固定在步骤（4）中获得的碳工作电极的工作区域，随后采用6-巯基-1-己醇封闭活性位点，然后利用S1链捕获microRNA；（6）将目标检测物microRNA和双链特异性核酸酶依次在步骤（5）中获得的碳工作电极的工作区域进行孵育并用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤；（7）DNA多联体的形成：将发夹DNA分子1（H1）和发夹DNA分子2（H2）上溶解于pH 7.4的PBS中，滴加至步骤（6）中获得碳工作电极的工作区域，原位增殖形成多支杂交链，继续滴加氯化血红素，形成氯化血红素/G-四联体结构，利用静电吸附作用将铂纳米粒子嵌入多支杂交链的主链中，形成具有生物催化作用的DNA多联体，可以催化H2O2分解生成O2；（8）在步骤（7）中获得的碳工作电极的工作区域，滴加10 μL含有0.01 M H2O2的pH 7.4的PBS，在氙灯的照射下，以印制的Ag/AgCl电极作为参比电极，印制的碳电极作为对电极，步骤（3）中获得的碳工作电极作为工作电极，利用三电极系统，通过时间-电流曲线法，在电压0.0 V下进行光电化学信号检测，绘制光电流强度与microRNA浓度的标准曲线，实现对microRNA的检测。 2.根据权利要求书1所述一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法，其特征是，利用电沉积方法将小面状的Cu2O修饰在电极工作区并将BiVO4/Bi2S3复合物修饰在Cu2O上的具体步骤为： a．在步骤（3）中获得的碳工作电极的工作区域沉积Cu2O：以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，步骤（3）中获得的碳工作电极作为工作电极，利用三电极系统，通过电位溶出分析法，在步骤（3）中获得的碳工作电极的工作区域沉积小面状的Cu2O，沉积电解液由浓度为0.02 M的乙酸铜和浓度为0.3-0.5 M的乳酸组成，电解液的pH由浓度为2 M的氢氧化钠调节为9-11之间，沉积电压为在-0.3 V和-0.5 V之间，沉积温度为60 ℃，沉积时间为25-45 min，沉积完成后，用二次水洗涤工作区域表面并在室温下自然干燥； b．合成BiVO4/Bi2S3复合物：首先通过水热法合成BiVO4，将1 mmol五水合硝酸铋溶于40-60 mL二次水和乙二醇的混合溶液中，其中二次水和乙二醇的体积比为1:1，依次加入1mmol偏钒酸钠和2.5-3.5 mmol琥珀酸二异辛酯磺酸钠，剧烈搅拌5-10 min后移入50 mL反应釜，在160 ℃条件下反应16-18小时，冷却至室温后分别用二次水和无水乙醇离心清洗3-5次，随后在60 ℃真空干燥4小时，获得BiVO4；取0.25 mmol已制备的BiVO4溶于40 mL二次水，加入0.05-0.2 mmol硫代乙酰胺并搅拌5-10 min后转移至50 mL反应釜，在120 ℃条件下反应8-10小时后，冷却至室温后分别用二次水和无水乙醇离心清洗3-5次，随后在60 ℃真空干燥4小时，获得BiVO4/Bi2S3复合物； c．将BiVO4/Bi2S3复合物与Cu2O复合：滴加10 μL质量分数为2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷于Cu2O表面，用pH 7.4的PBS洗涤工作区域并干燥后，滴加10 μL含有BiVO4/Bi2S3复合物和质量分数为2.5%戊二醛的混合液，干燥后用pH 7.4的PBS洗涤。 3.根据权利要求书1所述一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法，其特征是，所述的将发夹DNA链S1固定在步骤（4）所得的碳工作电极的工作区域，随后采用6-巯基-1-己醇封闭活性位点，然后利用S1链捕获microRNA的具体步骤为：将10 μL含有质量分数为2.5%的戊二醛和DNA链S1的混合液滴加至步骤（4）中获得的碳工作电极的工作区域，孵育2小时后，用含有0.05%吐温20的pH 7.4的PBS洗涤后滴加10 μL浓度为2 mM的6-巯基-1-己醇用于封堵非特异性结合位点，孵育30 min后用pH 7.4 PBS洗涤除去未结合的6-巯基-1-己醇并自然干燥。 4.根据权利要求书1所述一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法，其特征是，将目标检测物microRNA和双链特异性核酸酶依次在步骤（5）中获得的碳工作电极的工作区域进行孵育并用pH 7.4的PBS进行洗涤的具体步骤是：滴加10 μL不同浓度的microRNA至步骤（5）所述的电极工作区域，在37 ℃下孵化40 min，利用pH 7.4 PBS缓冲液洗去未结合的microRNA，随后滴加10 μL 0.05 U的双链特异性核酸酶孵育40 min，利用pH7.4的PBS清洗后在室温下干燥。 5.根据权利要求书1所述一种超灵敏检测microRNA的光电化学传感器的制备方法，其特征是，形成DNA多联体的具体步骤是： a．合成铂纳米粒子：取500-1000 μL浓度为20 mM的氯铂酸加入到20-50mL水和乙醇的混合溶液，其中水和乙醇的体积比为1:1，加入0.4-0.9 mol聚乙烯吡咯烷酮，在80 ℃回流4小时得到铂纳米粒子溶液； b．DNA多联体的制备：取10 μL含有H1和H2的混合液加入步骤（6）获得的碳工作电极的工作区域，所述的H1和H2浓度均为5 μM，在室温下孵育80 min后用pH 7.4的PBS洗涤除去未结合反应的H1和H2；随后滴加10 μL浓度为0.2 mM的氯化血红素溶液，室温下孵育50 min后利用pH 7.4的PBS洗涤，干燥后继续滴加10 μL制备的铂纳米粒子，最后用pH 7.4的PBS洗涤除去多余的铂纳米粒子。
所属类别：	发明专利