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原文传递蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用

专利名称：	蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用
摘要：	本发明涉及DNA分离、富集和检测领域，公开了一种蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用，该亲和探针包括表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子和负载在所述磁性微米粒子表面的N末端修饰有组氨酸标签的DNA损伤应答蛋白。本发明还包括了蛋白质功能化磁珠亲和探针的制备方法与应用。本发明构筑的蛋白质功能化磁珠亲和探针不仅结构稳定，只需负载少量蛋白样品，而且合成简单，成本低廉。此外，本发明蛋白质功能化磁珠亲和探针在使用时只需要少量的DNA损伤片段样品，即可实现DNA损伤片段的高效捕获，而且分离快速、简单，简化了操作步骤，省时、省力。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国科学院化学研究所
发明人：	徐艳;汪福意;罗群;赵耀;王媛媛;李向军
专利状态：	有效
申请日期：	2018-04-20T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-29T00:00:00+0800
申请号：	CN201810358170.5
公开号：	CN110389216A
代理机构：	北京润平知识产权代理有限公司
代理人：	严政;刘依云
分类号：	G01N33/53(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100190 北京市海淀区中关村北一街2号
主权项：	1.一种蛋白质功能化磁珠亲和探针，其特征在于，该亲和探针包括表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子和负载在所述磁性微米粒子表面的N末端修饰有组氨酸标签的DNA损伤应答蛋白。 2.根据权利要求1所述的亲和探针，其特征在于，相对于0.1mL磁性微米粒子，所述DNA损伤应答蛋白的负载量为0.05-4mg；优选地，相对于0.1mL磁性微米粒子，所述DNA损伤应答蛋白的负载量为0.1-1mg。 3.根据权利要求1所述的亲和探针，其特征在于，相对于1mL磁性微米粒子，所述磁性微米粒子的表面修饰过渡金属离子的量为20-120μmol。 4.根据权利要求1-3中任意一项所述的亲和探针，其特征在于，所述磁性微米粒子选自以超顺磁性Fe3O4@SiO2为内核的核壳结构复合粒子；优选地，所述过渡金属离子为Ni2+。 5.根据权利要求1-3中任意一项所述的亲和探针，其特征在于，所述磁性微米粒子的粒径为5-300μm。 6.根据权利要求1-3中任意一项所述的亲和探针，其特征在于，所述DNA损伤应答蛋白为DNA损伤的亲和结合蛋白，且N末端修饰有2-10个组氨酸；优选地，所述DNA损伤应答蛋白为HMGB1 A-box蛋白和/或PC4蛋白，且N末端修饰有6个组氨酸。 7.根据权利要求6所述的亲和探针，其特征在于，所述HMGB1 A-box蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO∶1所示；优选地，所述HMGB1 A-box蛋白的应答损伤DNA功能区域氨基酸序列如SEQ ID NO∶2所示；优选地，所述HMGB1 A-box蛋白的表达载体为pET-28a(+)。 8.根据权利要求6所述的亲和探针，其特征在于，所述PC4蛋白氨基酸序列中或/和第86位为精氨酸或/和第96位为甲硫氨酸或/和第104位为丝氨酸。 9.根据权利要求1-3中任意一项所述的亲和探针，其特征在于，所述DNA损伤为药物致DNA损伤；优选地，所述药物为金属抗肿瘤药物；更优选地，所述金属抗肿瘤药物为铂类抗肿瘤药物，通式为[Pt(Ⅱ)A2X2]；其中，A2为2个单齿氨配体或1个双齿氨配体，优选地，所述单齿氨配体为NH3，所述双齿氨配体为NH2C2H4NH2；X2为2个单齿阴离子配体或一个双齿阴离子配体，优选地，所述单齿阴离子配体为Cl。 10.一种根据权利要求1-9中任意一项所述的蛋白质功能化磁珠亲和探针的制备方法，其特征在于，包括：先将表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子在缓冲液中孵育、分离，然后在接触体系中，将N末端修饰有组氨酸标签的DNA损伤应答蛋白与表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子接触，然后将生成的DNA损伤应答蛋白-磁性微米粒子复合物进行清洗。 11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述接触体系为蛋白的缓冲溶液，所述接触的方式是在15-45℃下孵育5-35min；优选地，所述接触体系为0.5-1.5M的PBS缓冲溶液，所述接触的方式是在25-38℃下孵育15-20min。 12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述N末端修饰有组氨酸标签的DNA损伤应答蛋白与表面修饰有过渡金属离子的磁性微米粒子的体积比为150-250∶15。 13.一种根据权利要求1-9中任意一项所述的蛋白质功能化磁珠亲和探针在捕获和/或鉴定DNA损伤中的应用。 14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述捕获和/或鉴定DNA损伤包括以下步骤： (1)将权利要求1-9中任意一项所述的蛋白质功能化磁珠亲和探针与DNA损伤片段样品混合； (2)除去未结合的DNA损伤片段，分离得到捕获的磁珠-蛋白-DNA损伤片段复合物； (3)从捕获的磁珠-蛋白-DNA损伤片段复合物中分离DNA损伤片段，可选地进行鉴定；优选地，步骤(1)中，所述蛋白质功能化磁珠亲和探针与DNA损伤片段样品重量比为4-6∶1；优选地，步骤(1)中，所述混合的温度为25-38℃，时间为20-30min；优选地，步骤(2)中，所述捕获的磁珠-蛋白-DNA损伤片段复合物的分离方法选用磁铁吸附的方式吸附5-10min，将磁珠-蛋白-DNA损伤片段复合物吸附到离心管底部，弃去上清液，即得；优选地，步骤(3)中，所述DNA损伤片段的分离方法选用洗脱液洗脱、酚-氯仿抽提，即得；更优选地，所述洗脱液含有15-25mM NaH2PO4，350-450mM咪唑，450-550mM NaCl，pH7.5-8.5。
所属类别：	发明专利