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原文传递一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法

专利名称：	一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法
摘要：	本发明公开了一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，包括以下步骤：S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数约为80‑200万/mL；S2、奶牛血清和乳清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清。本发明通过制定全新的奶牛乳腺炎治疗策略，通过分离奶牛的血清和乳清检测了烟酸治疗后乳腺炎奶牛体内促炎介质的表达，利用分子生物学方法全面的评估了烟酸对奶牛乳腺炎的治疗效果，烟酸能够有效减少奶牛血清和乳清中促炎介质的表达，从而达到保护乳腺缓解炎症的功效。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	吉林;22
申请人：	吉林大学
发明人：	柳巨雄;郭文晋;付守鹏;曹宇;阚兴池
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-25T00:00:00+0800
申请号：	CN201910655276.6
公开号：	CN110376366A
代理机构：	北京棘龙知识产权代理有限公司
代理人：	谢静
分类号：	G01N33/50(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	130000 吉林省长春市绿园区吉林大学和平校区西安大路5333号
主权项：	1.一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、乳腺炎奶牛的筛选：初步筛选出乳腺炎为阳性的奶牛，其体细胞数约为80-200万/mL； S2、奶牛血清和乳清中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛中的外周血，然后提取血液中的血清； S3、奶牛乳汁中促炎因子的检测：分别在第0天和第7天收集正常奶牛、乳腺炎奶牛和饲喂烟酸的乳腺炎奶牛患病乳房或正常乳房中的乳汁，然后提取乳汁中的乳清； S4、CCK8实验将原代奶牛乳腺上皮细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔含有细胞约0.5×104个，加入培养基100μL，将细胞放入37℃和5％CO2的无菌恒温培养箱中培养24小时，然后加入不同浓度的烟酸或烟酸+LPS，待24小时后再次向每个孔中加入10μL的CCK8试剂，继续在培养基中培养2小时，然后取出96孔板放入酶标仪中在450nm波长处测定吸光光度； S5、烟酸对原代奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的抑制作用试验将0.3×105个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分为4组：正常组、烟酸组、LPS(1μg/ml)组、LPS+烟酸组，当细胞数达到培养皿的80％时，用无血清培养基代替培养基培养3小时后加入烟酸，再过1小时后加入LPS，3小时后收集培养皿中的原代奶牛乳腺上皮细胞，收集好的细胞用Trizol法提取总RNA并反转录成cDNA用于后续试验或者提取细胞中的总蛋白并应用BCA蛋白浓度测定法将细胞中的总蛋白含量统一用于后续试验，在后续试验中利用荧光定量PCR法检测原代乳腺上皮细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的基因表达，再利用western blot法检测原代奶牛乳腺上皮细胞中COX2和INOS的蛋白表达； S6、烟酸对GPR109A的激活作用将0.3×105个原代奶牛乳腺上皮细胞接种到60mm×15mm细胞培养皿中，分别用烟酸处理0h、1h、3h、6h和12h后收集细胞并提取细胞中的总蛋白，通过western blot的方法检测细胞中GPR109A的表达量。 2.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，其特征在于：筛选出的奶牛的特性为盘底沉淀物较多，比较粘稠，并有少量胶状物，倾斜测试盒时，沉淀物有明显黏附于盘底难于流动的现象，旋转测试盘时，沉淀物有向中心聚集的倾向。 3.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，其特征在于：乳汁中体细胞数的检测方法为：首先配制染色液，取40mL四氯乙烷和54mL乙醇，充分混合均匀，然后放置于65℃问水溶液中进行3min加热，再添加0.6g甲基蓝，最后放置于温度调整为4℃的冰箱中2小时，然后加入6mL冰醋酸，放于常温保存；我们再取一块干净的载玻片，滴入10μL的生鲜乳样品，放入恒温箱中干燥，再浸入染色液中，最后形成均匀的玻片；将制备好的样品放在计数板中进行染色细胞计数。 4.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，其特征在于：血液中血清的提取方法为：将步骤S2中采好的血液呈45度角放置于4℃冰箱中约1小时，然后用3000转的速度离心5分钟，收集上清液并应用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。 5.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，其特征在于：乳汁中乳清的提取方法为：将步骤S3中采好的乳汁用3000转的速度离心20分钟，收集上清液并应用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的蛋白表达。 6.根据权利要求1所述的一种烟酸通过GPR109A受体应用于治疗奶牛乳腺炎的实验方法，其特征在于：乳腺上皮细胞总蛋白的提取方法：利用蛋白提取试剂收集原代乳腺上皮细胞并提取总蛋白，应用western blot的方法检测奶牛乳腺上皮细胞中iNOS、COX-2和GPR109A的相对表达量。
所属类别：	发明专利